مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

الهدف العام من هذه التجربة هو تحسين كفاءة توليد فيروس اللقاح المتحور باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في إنشاء نواقل جديدة لفيروس اللقاحات للبحوث البيولوجية والبحوث الطبية ، ولا سيما للعلاج الجيني والتطعيم. يعد العرض الفيروسي بهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، لأنه من الصعب تحديد اللويحات الإيجابية والتقاطه.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تحسن بشكل كبير من الكفاءة في جعل متحولنا فيروس اللقاح. بدءا من خلايا CV-1 التي تم حصادها ، اضبط تركيزها على 100 ، 000 خلية لكل مليلتر. ثم قم بزرع ملليلترين من المعلق في كل بئر من صفيحة من ستة آبار للتعداد.

في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا ب 0.5 نانوجرام من gRNA-N2 البلازميد و 0.5 نانوجرام من بلازميد pSTCas9. ثم احتضنهم لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط.

بعد ذلك ، قم بإعداد فيروس VVL15. تمييع فيروس VVL15 العمود الفقري باستخدام DMEM إلى 200,000 PFU لكل مليلتر. ثم أضف 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف في كل بئر من خلايا CV-1 المنقولة.

بعد ساعتين ، قم بنقل الخلايا بميكروغرام واحد من ناقل المتبرع المكوكي للتعبير عن HR ، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، افصل خلايا CV-1 المنقولة باستخدام مكشطة الخلية. ثم اجمع معلق الخلية في مبرد وخزنه عند سالب 80 درجة مئوية لاستخدامه في المستقبل.

لبدء الجولة الأولى من تنقية VV المعدل ، قم بزرع 15 صفيحة من ستة آبار مع 300،000 خلية CV-1 غير معدلة لكل بئر. في اليوم التالي ، قم بإذابة التعليق المجمد لخلايا CV-1 المنقولة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، ثم قم بدوامة التعليق بقوة لمدة 30 ثانية لتحلل الخلايا. ثم قم بتخفيف ميكرولتر واحد من المحللة بثلاثة ملليلتر من DMEM.

أضف نصف مليلتر من هذا التخفيف إلى كل بئر من خلايا CV-1 غير المعدلة. ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة يومين. بعد يومين ، حدد اللويحات الإيجابية لطلب تقديم العروض باستخدام المجهر الفلوري.

يمكن رصدها بهدف 10X. عند تحديدها ، قم بتسمية اللويحات الموجودة أسفل اللوحة بدقة باستخدام قلم تحديد. الآن قم بإعداد مبرد يحتوي على 200 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل لكل لوحة موجبة يتم حصادها.

بعد ذلك ، من المهم شفط كل الوسائط من الآبار ذات اللويحات المصنفة. بعد ذلك، باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مضبوطة لشفط 30 ميكرولتر، قم بتحميل الماصة جزئيا ب 10 ميكرولتر من الوسط من التبريد، ثم كشط البلاك وسحب الخلايا مع الشفط المتبقي. أخرج هذا في الثلاجة وكرر هذا الإجراء مرتين أخريين ، واستهدف نفس البلاك الإيجابي لطلب تقديم العروض لجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا.

قم بتخزين المجموعات على درجة حرارة سالب 80 درجة مئوية أو ، إذا كان سيتم إجراء الجولة الثانية من التنقية على الفور ، فقم بتجميد المبردات على الثلج الجاف لمدة 10 دقائق. يتم تنفيذ الجولة الثانية من تنقية VV المعدل تماما مثل الأولى باستخدام الخلايا المجمدة من الجولة الأولى. ومع ذلك ، يمكن اختيار أكثر من ست لويحات موجبة لطلب تقديم العروض لكل خط إيجابي لطلب تقديم العروض.

كرر عملية الاختيار حتى تصبح جميع اللويحات المكونة من لوحة موجبة واحدة إيجابية لطلب تقديم العروض مما يشير إلى أن اللوحة نقية ، والتي يمكن أن تستغرق ثلاث إلى خمس جولات إضافية. قبل يوم واحد ، قم بإعداد صفيحة من ستة جدران بها نصف مليون خلية CV-1 لكل بئر. في اليوم التالي ، قم بإذابة البلاك المنقى المجمد عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.

ثم قم بتدوير البلاك بقوة لمدة 30 ثانية لعمل محللة. أضف كل المحللة ، بما في ذلك بقايا الخلية ، إلى بئر من خلايا CV-1 ، واحتضن اللوحة لمدة ثلاثة أيام. لا تستخدم الآبار الخمسة الأخرى.

افحص الخلايا يوميا تحت المجهر. عندما يبدو أكثر من نصف الخلايا اعتلال خلوي ، احصد الخلايا المصابة. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون جميع الخلايا اعتلال خلوي.

استخدم مكشطة خلية لجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلتر مع وسط ثقافة. ثم حبيبات الخلايا في 300 جرام لمدة ثلاث دقائق. تخلص من المادة الطافية واستمر في استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من تعديل VV المتحور ، أو قم بتجميد حبيبات الخلية عند سالب 80 درجة مئوية للقيام بذلك لاحقا.

تعمل الطريقة الموصوفة على تحسين كفاءة إعادة التركيب بأكثر من 100 ضعف مقارنة بالبروتوكولات التقليدية. على سبيل المثال ، تم استهداف VV N1LG للتعديل. كما هو موضح ، تم نقل البلازما التي تعبر عن Cas9 و gRNA الخاص ب N1L في خلايا CV-1 لتعزيز كفاءتها لإعادة التركيب المتماثل.

بعد يوم واحد من التعداء ، تم التعبير عن RFP في خلايا CV-1. بعد ذلك ، أصيبت خلايا CV-1 بالمحللة الكاملة من إعادة التركيب المتماثل. لوحظت لويحات إيجابية وسلبية في خلايا CV-1.

باتباع بروتوكول التنقية ، تم الحصول على مؤتلف نقي. قدمت جميع اللويحات بعد الإصابة بمحللة الخلية المشتقة من لوحة نقية بفيروس اللقاح المتحور إشارة RFP. تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من حذف الجين المستهدف.

أظهر الفيروس المعدل إشارة إيجابية لطلب تقديم العروض ، ولا توجد إشارة ل N1L ، على عكس التحكم السليم في N1L. كانت جميعها إيجابية للجين غير المستهدف A52R. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع ناقل جديد لفيروس اللقاح بسرعة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 10 أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم الطبية الحيوية لاستكشاف نواقل فيروسية جديدة في تطوير عوامل بيولوجية للعلاج والوقاية من السرطان والأمراض المعدية.