وسيلة فعالة للحصول على خلايا Dedifferentiated الدهون

الهدف العام من طريقة زراعة الخلايا الجديدة هذه هو توليد خلايا دهنية غير متمايزة بكفاءة أكبر. قد تساعد طريقتنا الباحثين العاملين في مجال الطب التجديدي في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول العمليات العديدة التي ينطوي عليها إنتاج الخلايا الشحمية والعظمية والغضروفية. نظرا لأن الميزة الأساسية لبروتوكول زراعة الخلايا لدينا هي أنه يعزز جودة خلايا DEFAT ، فقد يتم تطبيقه في المستقبل القريب لتحسين التطبيقات الحالية في العلاج الخلوي وهندسة الأنسجة.

بعد إحضار عينة الدهون تحت الجلد للمريض إلى المختبر من غرفة العمليات ، قم بوزن الأنسجة وضع عينة من جرام إلى جرامين من الأنسجة الدهنية في أنبوب سعة 15 ملليلترا. ثم اغسل العينة بخمسة ملليلتر من PBS ثم انقل العينة إلى طبق بلاستيكي بحجم 10 سم. قم بإزالة برنامج تلفزيوني.

ثم أضف 10 مل من الكولاجيناز المعقم بنسبة 0.1٪ لكل حجم إلى الطبق الذي يحتوي على العينة. بعد ذلك ، استخدم المقصا الجراحي لفرم الأنسجة حتى تصل إلى قوام مهروس. انقل الأنسجة المفرومة ومحلول الكولاجيناز إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر وهضمه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع الرج عند 60 دورة في الدقيقة.

بعد الهضم ، قم بتصفية العينة المهضومة من خلال مرشح 100 ميكرون في أنبوب جديد سعة 15 مل. ثم مرر 10 ملليلتر من وسط استزراع DEFAT المكمل ب 2٪ FBS عبر الفلتر. لعزل الخلايا الدهنية من معلق الخلية ، قم أولا بالطرد المركزي للخلايا المفلترة بمعدل 100 مرة جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد خمسة ملليلتر من DCM مكملا بنسبة 2٪ FBS في أنبوب سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لسحب الخلايا الدهنية العائمة من أنبوب الطرد المركزي وإضافة الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على وسط. رج الأنبوب برفق لخلط وسط DCM مع الخلايا.

ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 100 مرة جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، استخدم إبرة قياس 18 وحقنة سعة 20 مليلتر لإزالة الوسط الموجود في الجزء السفلي من الأنبوب. ثم أضف 10 مل من DCM مكملا بنسبة 2٪ FBS إلى الخلايا واخلطها عن طريق هز الأنبوب برفق.

الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 100 مرة جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لبدء الطلاء ، أضف 41 مل من DCM أو DMEM مع 20٪ FBS إلى قارورة 12.5 سم. ثم استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لسحب 40 ميكرولتر من الخلايا الدهنية وإضافتها إلى القارورة.

ثم املأ القارورة ب DCM أو DMEM مكملة بنسبة 20٪ FBS. من الأهمية بمكان أن تنتشر الخلايا في جميع أنحاء الوسط. ضع القارورة على غطاء طبق بتري دائري لإبقائه مسطحا.

أخيرا ، ضع القارورة داخل حاضنة مضبوطة على 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية واتركها دون إزعاج لمدة سبعة أيام. بعد أسبوع من الحضانة ، اقلب القارورة وتحقق من وجود خلايا دهنية غير متمايزة. بعد ذلك ، قم بشفط الوسائط ثم أضف خمسة ملليلتر من DCM أو DMEM مكملا بنسبة 20٪ FBS إلى القارورة.

اسمح لخلايا DEFAT بالنمو لمدة أسبوع آخر بعد تغيير الوسط. بعد أسبوع ، استخدم عداد الخلايا لحساب عدد خلايا DEFAT المتولدة في ظل ظروف زراعة الخلايا المختلفة. تظهر هذه الصورة مستعمرات خلايا DEFAT بعد 14 يوما من الزراعة في DMEM.

هنا تظهر خلايا DEFAT بعد 14 يوما من الثقافة في DCM. في كل حالة ، يمثل شريط المقياس 200 ميكرون. تم قياس تكاثر خلايا DEFAT باستخدام عداد الخلايا ، وتمت مقارنة كفاءة DCM و DMEM في توليد خلايا DEFAT.

كما هو موضح هنا ، لوحظ تعزيز تكاثر الخلايا باستخدام DCM. هنا ، تم استزراع خلايا DEFAT البشرية ، التي تم إنشاؤها باستخدام DCM ، لمدة ثلاثة أسابيع في وسائط الحث المناسبة لتقييم قدرات إعادة التمايز والتمايز لخلايا DEFAT. كانت الخلايا إيجابية لقدرة العظم عن طريق صبغة الفوسفاتيز القلوية والتلوين باستخدام Alizarin Red S. أخيرا ، تم إظهار القدرة الشحمية مع صبغة Oil Red O.

من المهم جدا التأكد من أن الكولاجيناز مع عزل الخلايا الدهنية والبدائية يتم إجراؤه بأقصى قدر من العناية من أجل توليد خلايا DEFAT عالية الجودة بنجاح. من خلال هذه الجهود ، تهدف طريقة زراعة الخلايا التي تم التحقق من صحتها إلى تسهيل الجهود البحثية الحالية والمستقبلية في مجالات علم الأحياء التنموي والطب التجديدي.