محاكاة وظيفة من البروتينات اشارة: نحو الاصطناعي الإشارة العلاج تنبيغ

الهدف العام من هذه التجربة هو المتابعة الطيفية للاتصال غير الطبيعي بين بروتينين ناتجين عن محول طاقة كيميائي اصطناعي. توضح الوثيقة إمكانية تطوير نظائر اصطناعية لبروتينات الإشارات التي ستكون قادرة على تنفيذ مسارات نقل الإشارات غير الموجودة في الطبيعة. يمكن أن تساعد القدرة على متابعة اتصال البروتين غير الطبيعي بالبروتين بواسطة مقياس الطيف الضوئي المشترك في تطوير وتحسين وظيفة محولات الطاقة الكيميائية الاصطناعية وتقربنا من تحقيق علاج نقل الإشارات الاصطناعية.

يتكون محول الطاقة الكيميائي من عامل نمو مشتق من الصفائح الدموية ، أو PDGF aptamer. مثبط ثنائي التكافؤ من إيثاكرينيك أميد GST ، فلوروفور ومروء. لن يتم توضيح تخليق محول الطاقة الكيميائي في هذا الفيديو.

ولكن موصوف في بروتوكول النص. يتم توضيح مبادئ تشغيل محول الطاقة الكيميائي هنا. يثبط محول الطاقة الكيميائي النشاط الأنزيمي لضريبة السلع والخدمات ، عندما تربط مجموعتا EA المواقع النشطة للإنزيمات.

تؤدي إضافة PDGF إلى تكوين مجمع محول الطاقة الكيميائي PDGF. مما يعطل تفاعل محول الطاقة وضريبة السلع والخدمات ، وبالتالي استعادة النشاط الأنزيمي لضريبة السلع والخدمات. تؤدي الإضافة التالية لأبتامر PDGF غير المعدل إلى إطلاق محول الطاقة الكيميائي وتسمح له بإعادة تثبيط الإنزيم.

قبل بدء التجارب لفحص التحكم في نشاط ضريبة السلع والخدمات بواسطة PDGF ، قم بإعداد إجراء تجريبي في قارئ اللوحة للقياس الحركي. إنشاء تجربة جديدة كبروتوكول قياسي. حدد إجراء لفتح نافذة إعدادات الإجراء.

في القائمة المنبثقة على الجانب العلوي من النافذة ، اختر نوع اللوحة 384 وفقا للشركة المصنعة للوحة. حدد قراءة في القائمة اليسرى. اختر الامتصاص لطريقة الكشف.

ونقطة النهاية لنوع القراءة. في نافذة الطول الموجي ، اكتب 340 نانومتر. حدد لوحة كاملة ، واختر الآبار المراد قياسها.

ثم انقر فوق موافق لإغلاق نافذة القراءة. في القائمة اليسرى ، اختر Start Kinetic. اضبط وقت التشغيل على 10 دقائق.

حدد خيار الحد الأدنى للفواصل الزمنية. ثم انقر فوق موافق لإغلاق النافذة الحركية. اسحب خط القراءة إلى القياس الحركي.

حدد الزر التحقق من الصحة، متبوعا بالزر موافق. احفظ التجربة. حدد زر تشغيل.

سيظهر مربع حوار ، لكن لا تحدد الزر موافق حتى يصبح جاهزا لبدء القياس الحركي. بمجرد إعداد قارئ اللوحة ، فإن الخطوة التالية هي إعداد العينات لقياس نشاط ضريبة السلع والخدمات في وجود محول الطاقة الكيميائي و PDGF. من أجل اختبار أربعة تركيزات من PDGF في ثلاث نسخ ، قم بإعداد أربع عينات تحتوي كل منها على 3.25 ميكرولتر من محول الطاقة الكيميائي ، و 3.25 ميكرولتر من GST M-1.

أضف إلى كل عينة صفرا أو 1.2 أو 2.4 أو 4.9 ميكرولتر من PDGF على التوالي. ثم أضف الحجم المناسب للمخزن المؤقت للفحص إلى كل عينة ليصل الحجم الإجمالي إلى 130 ميكرولترا. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد 10 دقائق ، انقل 40 ميكرولترا من كل عينة إلى آبار لوح بئر شفاف 384. انقل كل من العينات الأربع إلى الآبار الفردية أو الزوجية في نفس الصف فقط. للسماح باستخدام ماصة متعددة لإضافة الركيزة.

بعد ذلك ، استخدم ماصة متعددة القنوات من 12 قناة لإضافة 10 ميكرولتر من كل ركيزة معدة مسبقا في لوح 96 بئر بسرعة إلى كل عينة. تخلط بسرعة ، ولكن برفق ، لتجنب الفقاعات. أدخل اللوحة على الفور في قارئ اللوحة، وابدأ القياس الحركي عن طريق تحديد الزر موافق في مربع الحوار.

لفحص دورات تثبيط تنشيط GST بوساطة محول الطاقة الكيميائي ، قم بإعداد خمس عينات ، تحتوي كل منها على 84.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص. 3.25 ميكرولتر من محول الطاقة الكيميائي ، و 3.25 ميكرولتر من GST M1-1. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.

أضف 3.65 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص لعينة واحدة ، و 3.65 ميكرولتر من PDGF إلى العينات الثانية والثالثة والرابعة وخمسة. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. أضف 3.12 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى العينتين الأولى والثانية ، و 3.12 ميكرولتر من أبتامير PDGF إلى العينات الثالثة والرابعة والخامسة.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. أضف 24.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى العينات الأولى والثانية والثالثة. و 24.4 ميكرولتر من PDGF للعينات الرابعة والخامسة.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. أضف 7.8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى عينات واحدة إلى أربع عينات ، و 7.8 ميكرولتر من أبتامير PDGF لأخذ عينات خمسة. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

انقل العينات إلى صفيحة بئر شفافة 384. لإجراء التجربة في ثلاث نسخ ، وإضافة الركيزة بسرعة إلى العينات. أدخل اللوحة في القارئ ، وابدأ القياس الحركي.

لبدء هذا الفحص ، قم بإعداد إجراء تجريبي في قارئ اللوحة للقياس الحركي كما هو موضح في نص البروتوكول. قم بإعداد عينتين في بئرين من لوح بئر شفاف 384. لكل بئر ، امزج ميكرولتر واحد من GST M1-1 وميكرولتر واحد من محول الطاقة الكيميائي في 38 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص.

اترك بئر فارغة بين البئرين. باستخدام ماصة متعددة القنوات ذات 12 قناة ، أضف بسرعة 10 ميكرولتر من الركيزة إلى كل بئر. واخلطهم برفق وبسرعة لتجنب الفقاعات.

أدخل اللوحة على الفور في القارئ وابدأ القياس الحركي. عندما يفتح قارئ اللوحة بعد 3.5 دقيقة ، أضف بسرعة 1.125 ميكرولتر من PDGF إلى أحد الآبار ، واخلطه برفق ، واترك اللوحة بالعودة إلى القارئ للقياسات الحركية المتبقية. قبل تحضير العينات لهذه التجربة ، قم بإعداد إجراء تجريبي في قارئ اللوحة للقياس الحركي كما هو موضح في نص البروتوكول.

سيتم استخدام مجموعة قياس ألوان النتريت / النترات لقياس إنتاج أكسيد النيتريك. في صفيحة 96 بئر ، قم بتوزيع 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص لكل بئر في الصف الأول. 70 ميكرولتر من كاشف Griess One لكل بئر في الصف الثاني.

و 70 ميكرولتر من كاشف Griess Two لكل بئر في الصف الثالث. قم بإعداد أربع عينات ، تحتوي كل منها على 4.8 ميكرولتر من محول الطاقة الكيميائي. لأخذ عينة واحدة ، أضف 155.2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص.

لأخذ عينة من اثنين ، أضف 3.2 ميكرولتر من GST M1-1 ، و 152 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص. لأخذ عينات من ثلاثة ، أضف 9.6 ميكرولتر من PDGF ، و 145.6 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص. ولأخذ عينات أربعة ، أضف 3.2 ميكرولتر من GST M1-1 ، و 9.6 ميكرولتر من PDGF ، و 142.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص.

احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بتوزيع 50 ميكرولترا من العينة لكل بئر في صفيحة بئر شفافة 384 لإجراء التجربة ثلاث نسخ. قم بتوزيع العينات فقط على الآبار الفردية أو الزوجية في نفس الخط للسماح باستخدام ماصة متعددة لإضافة الركيزة.

أضف 0.54 ميكرولتر من عقار JS-K إلى كل عينة. أضف بسرعة إلى كل عينة 10 ميكرولتر من محلول الجلوتاثيون واخلطها برفق وبسرعة لتجنب الفقاعات. أدخل اللوحة في القارئ ، وابدأ القياس الحركي.

مباشرة بعد القياس الحركي ، انقل 50 ميكرولترا من كل عينة إلى كل بئر من الصف الأول من لوحة البئر 96 مع المخزن المؤقت للفحص. ثم انقل 50 ميكرولترا من كل بئر من الصف الثاني من اللوحة إلى آبار الصف الأول من اللوحة. و 50 ميكرولتر لكل بئر من الصف الثالث من اللوحة إلى آبار الصف الأول من اللوحة.

احتضن مع الحماية من الضوء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قبل قياس الامتصاص عند 550 نانومتر. أظهر قياس نشاط ضريبة السلع والخدمات بدون محول الطاقة الكيميائي ، ومع محول الطاقة الكيميائي أن محول الطاقة الكيميائي يثبط نشاط ضريبة السلع والخدمات.

يتم إعادة تنشيط ضريبة السلع والخدمات عن طريق إضافة تركيزات متزايدة من PDGF إلى مجمع محول الطاقة الكيميائي لضريبة السلع والخدمات. كشفت الإضافات المتسلسلة ل PDGF ، وأبتامير PDGF غير المعدل إلى مجمع محول الطاقة الكيميائي لضريبة السلع والخدمات أن الاتصال بين PDGF و GST كان قابلا للعكس. أدت إضافة PDGF إلى مجمع محول ضريبة السلع والخدمات إلى زيادة سريعة في نشاط ضريبة السلع والخدمات ، بعد 3.5 دقيقة من إضافة الركائز.

في حين أن إضافة أبتامر PDGF إلى خليط من ضريبة السلع والخدمات ، PDGF ومحول الطاقة الكيميائي أدى إلى انخفاض في نشاط ضريبة السلع والخدمات. تشير هذه النتائج إلى أن النظام يستجيب في الوقت الفعلي للتغيرات في بيئته. بعد ذلك ، تم التحقيق في قدرة هذا النظام على التحكم في تنشيط الأدوية الأولية باستخدام JS-K ، وهو دواء مضاد للسرطان يتم تنشيطه بواسطة ضريبة السلع والخدمات لإطلاق أكسيد النيتريك السام.

أكدت قياسات كميات أكسيد النيتريك المنبعثة عند إضافة JS-K إلى محول الطاقة الكيميائي ومجموعات مختلفة من GST و PDGF أن وجود كل من GST و PDGF فقط هو الذي ينشط JS-K. كل هذا يوضح كيف يمكن لعامل اصطناعي تمكين عامل النمو لتحريك النشاط التحفيزي للجلوتاثيون S-ترانسفيراز ، وهو ليس شريكه الطبيعي في الإنزيم. لذلك يمكن استخدام المحاكاة الحيوية المستقبلية لهذه الفئة لتغيير استجابة الخلايا للإشارات البيئية أو تزويدها بخصائص جديدة.