عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة لغير الترميز الصغيرة RNA الكمي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد كمية الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر على البروتينات الدهنية المنقاة. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البروتين الدهني ، مثل تحديد توقيعات الحمض النووي الريبي الصغير للبروتين الدهني في الصحة والمرض ، بالإضافة إلى تطوير الحمض النووي الريبي الصغير للبروتين الدهني كمؤشرات حيوية للمرض ، أو رسائل خلية إلى خلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء تحليل البروتينات الدهنية عالية النقاء لتغيرات الحمض النووي الريبي الصغيرة في المرض أو الظروف التجريبية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية لعلاج أمراض القلب والتمثيل الغذائي ، لأن الحمض النووي الريبي خارج الخلية هي فئة جديدة من المؤشرات الحيوية للأمراض والبروتين الدهني للحمض النووي الريبي الصغير لديه إمكانات مثيرة كأهداف دوائية في الدراسات المستقبلية. على الرغم من أن هذه الطريقة مصممة للحمض النووي الريبي الصغير HDL ، إلا أنه يمكن أيضا تكييفها مع الحمض النووي الريبي الصغير منخفض الكثافة والبروتين الدهني منخفض الكثافة. بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، بسبب نقص المعدات والخبرة المناسبة في إعداد العينات للطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة.

يتكون هذا البروتوكول من طرق راسخة مرتبطة ببعضها البعض لقياس كمية الحمض النووي الريبي الصغير على HDL عالي النقاء ، باستخدام تسلسل عالي الإنتاجية ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. يتناول هذا الفيديو تنقية HDL. سيتم عرض هذا البروتوكول من قبل مساعدي ، إيفان شادري.

للبدء ، أضف 90 ميكرولترا من مضادات الأكسدة 100x إلى تسعة ملليلتر من البلازما. بعد ذلك، اضبط كثافة البلازما على 1.025 جرام لكل ملليلتر، بإضافة 0.251 جرام من بروميد البوتاسيوم لكل تسعة ملليلتر من البلازما. هز البلازما في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب كل الملح.

بعد ذلك ، انقل البلازما إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، وتأكد من وجود طبقة من الفقاعات في الأعلى. يجب ألا يكون هناك هواء محاصر تحت البلازما. بعد ذلك ، قم بإعداد إبرة قياس 18 عن طريق إضافة ثني 90 درجة سنتيمترا واحدا من الحافة ، بحيث يكون الجانب المشطوف متجها لأعلى.

بعد ذلك ، باستخدام حقنة وإبرة مثنية ، ضع بعناية ثلاثة ملليلتر من محلول التراكب رقم واحد على البلازما. قم بإزالة غالبية الفقاعات الموجودة على السطح ، واترك ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات بين الغضروف المفصلي وحافة الأنبوب. بعد ذلك ، ضع الأنابيب بعناية في دلاء SW 40 Ti.

قم بوزن كل دلو باستخدام الأغطية ، وقم بموازنة الدلاء التي ستشغل مواضع متعاكسة في جهاز الطرد المركزي. بعد ذلك ، ضع الدوار في جهاز الطرد المركزي الفائق ، وقم بتشغيله عند 274 ، 400 مرة G لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية ، مع ضبط الكسر بشكل وسيط عند قيمة أربعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة الدلاء بعناية من الدوار ، وارفع الأنابيب من الدلاء.

ثم قم بإزالة ملليلترين ببطء من الطبقة العليا من التراكب ، باستخدام حقنة وإبرة مثنية. هذا هو كسر VLDL IDL. ثم اجمع السبعة ملليلتر المتبقية من البلازما ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

ارفع حجم البلازما إلى تسعة ملليلتر عن طريق إضافة محلول التراكب رقم اثنين. ثم اضبط الكثافة إلى 1.080 جرام لكل مليلتر بإضافة 0.746 جرام من بروميد البوتاسيوم. بعد ذلك ، قم بهز العينة برفق لإذابة الملح ، الأمر الذي سيستغرق حوالي 20 دقيقة.

بعد ذلك ، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي فائق دون حبس أي هواء. تأكد من عمل طبقة من الفقاعات في الأعلى. باستخدام الإبرة المثنية ، قم بتراكب ثلاثة ملليلتر بعناية من محلول التراكب رقم ثلاثة.

بعد ذلك ، قم بإزالة غالبية الفقاعات وقم بتحميل الأنابيب بعناية في دلو SW 40 Ti. قم بموازنة وتدوير هذه الحلقات ، كما هو موضح سابقا ، لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة ملليلترين بعناية من الطبقة العليا من التراكب باستخدام الإبرة المنحنية.

هذا هو جزء LDL. بعد ذلك ، انقل العينة المتبقية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مليلتر ، ورفع الحجم إلى تسعة ملليلتر بالمحلول رقم أربعة. الآن اضبط الكثافة إلى 1.30 جرام لكل مليلتر عن طريق إضافة حوالي 3.33 جرام من بروميد البوتاسيوم وهز العينة حتى يذوب الملح.

بعد ذلك ، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي فائق وثلاثة ملليلتر من المحلول رقم خمسة بعناية. الآن ، قم بالطرد المركزي الفائق للعينة كما كان من قبل ، ولكن لمدة 48 ساعة. بعد يومين ، اجمع أعلى ملليلترتين من التراكب باستخدام حقنة وإبرة مثنية.

هذا يشكل كسر HDL. لإزالة محاليل الملح العالية ، انقل جزء HDL إلى غلاف غسيل الكلى الرطب مع قطع الوزن الجزيئي 10،000. ثم قم بغسيل الكلى لمدة 24 ساعة في لتر من XPBS مع التحريك اللطيف عند أربع درجات مئوية.

استبدل محلول PBS ثلاث مرات خلال فترة 24 ساعة. في وقت لاحق ، حدد تركيز البروتين لجزء HDL باستخدام طريقة BCA. الحويصلات خارج الخلية ، أو الإكسوسومات ، لها كثافة مماثلة ل HDL الصغير ، وبالتالي يمكن أن تكون موجودة في نفس جزء الكثافة مثل HDL.

وبالتالي ، يتطلب جزء HDL مزيدا من التنقية بواسطة FPLC. مباشرة قبل استخدام FPLC ، قم بتشغيل 1.2 ملليغرام من جزء DGUC HDL في 500 ميكرولتر من المحلول من خلال مرشح طرد مركزي 0.22 ميكرون. اجمع العينة المفلترة في حقنة حقن FDLC ، مما يضمن عدم احتجاز فقاعات الهواء.

بعد ذلك ، اضبط معدل تدفق FPLC على 0.3 مل في الدقيقة مع حد ضغط عند 2.6 ميجا باسكال. بعد ذلك ، قم بموازنة الأعمدة ب 0.2 وحدة تخزين مؤقت. الآن قم بحقن العينة بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت في أداة FPLC ، وابدأ التشغيل.

اجمع 1.5 ملليلتر من الكسور ليصبح المجموع 72 كسورا. حدد كسور FPLC المقابلة ل DGUC HDL عن طريق تحديد مستويات الكوليسترول الكلي باستخدام مجموعة قياس الألوان وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. توقع العثور على ستة إلى سبعة كسور FPLC تحتوي على DGUC HDL.

قم بتجميع جميع الكسور المحتوية على HDL وتركيزها باستخدام مرشح طرد مركزي مقطوع 10 كيلودالتون عند 4 ، 000 مرة جم لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية ، أو حتى يصبح تركيز HDL حوالي 100 ميكرولتر. بعد ذلك ، اجمع تركيز HDL وحدد كمية البروتين باستخدام طريقة BCA. في وقت لاحق ، استخدم نفس الكمية من البروتين الكلي HDL لعزل الحمض النووي الريبي.

تم تجزئة البلازما البشرية بواسطة FPLC دون استخدام فصل التدرج الكثافة. ستة أجزاء تتوافق مع HDL وستة إلى البروتين الدهني منخفض الكثافة للغاية. تم قياس الدهون باللون الأسود والكوليسترول باللون الأحمر والبروتين باللون الأزرق بواسطة مجموعات قياس الألوان.

وبالمقارنة ، أدى استخدام الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة قبل FPLC إلى العثور على البروتين الدهني والكوليسترول بشكل حصري تقريبا في أجزاء HDL. من HDL المأخوذ من أربعة متبرعين أصحاء بالبلازما ، تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي وتسلسله باستخدام بروتوكول زوج أساسي 50 قراءة واحدة. يوضح توزيع القراءات الطبيعية وإثراء الحمض النووي الريبي الصغير حول 21 و 34 نيوكليوتيد.

أظهر تحليل المكتبة أن 38 في المائة من القراءات كانت عبارة عن RNAs دقيقة ، و 37 في المائة مشتقة من TRNAs. كانت الحمض النووي الريبي المتنوع ، والحمض النووي الريبي الريبوسومي ، والحمض النووي الريبي الصغير ، والحمض النووي الريبي النووي الصغير ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر موجودا أيضا. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون عشرة أيام ، عند إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من صحة تغييرات الحمض النووي الريبي الصغيرة HDL التي لوحظت مع تسلسل عالي الإنتاجية بطريقة أخرى ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو النشاف الشمالي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى ، مثل قدرة قبول التدفق الإلكتروني لكوليسترول البروتين الدهني عالي الكثافة وSAs المضادة للالتهابات HDL ، أثناء خطوات عزل الحمض النووي الريبي وتسلسل خطوات الإعداد للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل تحديد العلاقة بين تغيرات الحمض النووي الريبي الصغير HDL ووظيفة HDL. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات الدهون والبروتينات الدهنية ، لدراسة البضائع غير الكوليسترول ، وخاصة الأحماض النووية وأمراض التمثيل الغذائي ، على سبيل المثال فرط كوليسترول الدم أو مرض السكري.

ولا تنس أن العمل مع البلازما البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب على المرء أن يحصل على تدريب مناسب على مسببات الأمراض المنقولة بالدم ، ويجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند إجراء هذه التقنية.