Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيف يمكن استخدام قياس الطيف الكتلي الكهربائي الشعري ، أو CE-MS ، باستخدام واجهة بدون غمد وطرف مسامي ، لتحليل المستقلبات شديدة القطبية والمشحونة. بافتراض أنه لا يمكن شحن مستقلبات في كثير من الأحيان ، ويمكن أن تكون كاتيونية أو أنيونية ، ولفصلها ، فإن الفصل الإلكتروليتي مثل الرحلان الكهربائي الشعري ، هو الطريقة الأنسب. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، لم تكن الحساسية جيدة بما فيه الكفاية.

كان ذلك بسبب الواجهة ولم تكن الطريقة قوية أيضا. لكنني أعتقد أننا قمنا بحل كلتا المشكلتين بشكل جيد باستخدام غمد كواجهة مجانية واستخدام هذا البروتوكول الجديد. يمكن استخدام قياس الطيف الكهربائي الكتلي للرحلان الكهربائي الشعري باستخدام واجهة طرف مسامية جديدة عديمة الغلاف لمعالجة الأسئلة السريرية الرئيسية في مجال التمثيل الغذائي.

على سبيل المثال ، يمكن بسهولة تحديد ملامح المستقلبات عالية الشحنة القطبية باستخدام هذه التقنية. S المركبات مفصولة على أساس نسبة الشحنة إلى الحجم. في كثير من الأحيان تكون هذه التقنية مناسبة جدا لتنميط هذا النوع من حجم المركبات المسمى بالعينات البيولوجية.

تتمثل الميزة الفريدة لمنهجية CE-MS المقترحة بدون غمد في أنه يمكن استخدامها لتنميط المستقلبات الأنيونية والكاتيونية عن طريق تبديل قطبية جهد CE وقطبية الكشف عن MS فقط. بشكل عام ، سيكافح الأشخاص الجدد في هذه الطريقة لأن CE-MS يعتبر تقنية جديدة ومعقدة نسبيا. لبدء هذا الإجراء ، ضع خرطوشة سيليكا جديدة عارية منصهرة مع باعث طرف مسامي في الرحلان الكهربائي للمنطقة الشعرية ، أو أداة CE.

ضع شطف الميثانول الأمامي عند 50 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 15 دقيقة باستخدام البرنامج الذي يتحكم في أداة CE. وتحقق بصريا مما إذا كان السائل يتدفق من مخرج الشعيرات الدموية. بعد ذلك ، قم بإجراء شطف في الاتجاه المعاكس عند 50 رطل لكل بوصة مربعة لمدة خمس دقائق باستخدام إلكتروليت الخلفية ، أو محلول BGE ، لفحص ما إذا كان السائل يتدفق من الشعيرات الدموية الموصلة.

كرر الخطوة السابقة عند ضغط 100 رطل لكل بوصة مربعة في حالة عدم ملاحظة تدفق السائل من مخرج الشعيرات الدموية. بعد ذلك ، اشطف الشعيرات الدموية للفصل بالماء عند 50 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق ، متبوعا ب 0.1 مولار من هيدروكسيد الصوديوم عند 50 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق ، والماء عند 50 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق ، ومحلول BGE عند 50 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة طرف البخاخ لخرطوشة السيليكا المنصهرة من أنبوب الماء وتثبيته في محول مصدر الرش النانوي للاقتران بأداة MS.

تأكد من أن ارتفاع قوارير محلول BGE في أداة CE تتطابق مع ارتفاع طرف البخاخ. تحقق من تدفق السائل عبر الشعيرات الدموية الموصلة عن طريق الشطف بمحلول BGE عند 50 رطل لكل بوصة مربعة لمدة خمس دقائق. خلال خطوة الشطف هذه ، يجب ملاحظة انخفاض سائل في قاعدة تأين الرش الكهربائي ، أو إبرة البخاخ ESI.

بعد الشطف ، اغسل الشعيرات الدموية للفصل بمحلول BGE عند 50 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق في الاتجاه الأمامي. يجب ملاحظة انخفاض سائل عند طرف باعث الطرف المسامي خلال هذه الخطوة. الآن ، ضع باعث الطرف المسامي إلى مدخل مدخل MS على مسافة تقريبية من اثنين إلى ثلاثة مم.

قم بتطبيق جهد 30 كيلو فولت باستخدام وقت منحدر مدته دقيقة واحدة وابدأ في الحصول على بيانات MS في نطاق الكتلة إلى الشحن من 65 إلى 1000 لدراسات التنميط الأيضي باستخدام جهد ESI أولا من الصفر. اضبط جهد ESI على 1000 فولت أثناء قياس البيانات. قم بزيادة جهد ESI بزيادات قدرها 200 فولت حتى يتم ملاحظة إشارة خلفية ثابتة لمدة 15 دقيقة على الأقل.

انقل 20 ميكرولترا من خليط المستقلب الأنيوني القياسي المعد مسبقا إلى 100 ميكرولتر ميكروفيال فارغ. ضع القارورة الدقيقة في قارورة CE ، وضع قارورة CE في صينية عينة المدخل. ابدأ طريقة وضع الأيونات السالبة لاكتساب MS التي تم إنشاؤها مسبقا ، ثم ابدأ تسلسل CE باستخدام البرنامج الذي يتحكم في أداة CE.

بعد ذلك ، اشطف الشعيرات الدموية المنفصلة بمحلول BGE عند 50 رطل لكل بوصة مربعة لمدة ثلاث دقائق ، متبوعة بالحقن عند اثنين لكل بوصة مربعة لمدة 60 ثانية و psi واحد لمدة 10 ثوان. قم بتطبيق جهد 30 كيلو فولت مع وقت منحدر مدته دقيقة واحدة وضغط 0.5 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة عند المدخل. بعد فصل كهربائي لمدة 30 دقيقة ، أوقف الحصول على بيانات MS وقم بتقليل جهد CE إلى 1 كيلو فولت باستخدام وقت منحدر مدته خمس دقائق.

بين حقن العينة ، اشطف الشعيرات الدموية الفاصلة بالماء ، وهيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار ، والماء ، ومحلول BGE عند 30 رطل لكل بوصة مربعة لمدة ثلاث دقائق. بمجرد اكتمال عمليات التشغيل ، قم بتحليل البيانات المسجلة عن طريق تحديد أوقات الهجرة وشدة الإشارة لخليط المستقلب الأنيوني الذي تم تحليله. تقييم ما إذا كانت معايير المستقلب الأنيوني تظهر في المنطقة بين 10 و 28 دقيقة.

بعد ذلك ، تحقق مما إذا كانت الأيزومرات الثلاثة ذات الصلة بهيكل ، D-glucose 1-phosphate و D-glucose 6-phosphate و D-fructose 6-phosphate ، منفصلة جزئيا. تم توضيح أداء الفصل لطريقة CE-MS الخالية من الغلاف لتحليل المستقلبات الأنيونية عالية القطبية لثلاثة أيزومرات فوسفات السكر ذات الصلة بالهيكل. على الرغم من عدم الحصول على فصل أساسي لهذه التحليلات الثلاثة ، إلا أن الفصل الجزئي كاف للسماح باكتشافها الانتقائي بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد ، حيث أن هذه التحليلات لها نفس الكتلة الدقيقة.

عند تحليل العينات البيولوجية ، باستخدام منهجية CE-MS الخالية من الغلاف ، من المهم التحقق بانتظام من الأداء التحليلي بمرور الوقت باستخدام المعايير الأكاديمية. بشكل عام ، تسمح المنهجية الخالية من الغلاف بتنميط هذا النوع من المركبات في عينات بيولوجية صغيرة جدا ، وبالتالي فتح الكثير من الاحتمالات لتحليل هذا النوع من العينات في مجالات العلوم الطبية الحيوية ، ومجالات الكيمياء التحليلية الحيوية ، ومجالات البحث في الخارج. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إقران CE ب MS عبر واجهة مسامية عديمة الغلاف لتنميط المستقلبات شديدة القطبية والمشحونة.