طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الجزيئات الصغيرة القادرة على تعطيل التفاعل بين قنوات TRIP8b و HCN. تحدد هذه الطريقة الجزيئات المرشحة التي يمكن تطويرها إلى علاجات جديدة للاكتئاب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إكمالها بطريقة عالية الإنتاجية.

هذه التقنية لها آثار على تطوير علاج جديد لاضطراب الاكتئاب الشديد لأن مختبرنا أظهر أن تعطيل ارتباط TRIP8b ب HCN قد يكون ذا فائدة علاجية. على الرغم من أن هذه الطريقة تم تطويرها مع وضع الاكتئاب في الاعتبار ، إلا أن تعطيل التفاعل بين TRIP8b و HCN قد يكون ذا فائدة علاجية في اضطرابات أخرى مثل الألم المزمن. يعد العرض المرئي لهذا البروتوكول مهما لأنه يوضح فوائد استخدام الأدوات الآلية عالية الإنتاجية لتعزيز البحث الأساسي والانتقالي في المرافق المفتوحة مثل مختبر تحليل الإنتاجية العالية بجامعة نورث وسترن.

بعد تنقية جزء البروتين TRIP8b 241-602 وفحص تفاعلات البروتين البروتيني مع تحكم إيجابي وفقا لبروتوكول النص ، قم بإذابة أجزاء TRIP8b و HCN1-FITC واحتفظ بها على الجليد. استخدم FP Buffer لتحضير 20 مل من 2 ميكرومولار TRIP8b و 50 نانومولار HCN1-FITC. ثم قم بتوزيع 25 ميكرولترا من الخليط في كل بئر من صفيحة ميكروتيتر سوداء منخفضة الارتباط 384 جيدا.

لفحص المكتبة ، استخدم معالج السائل الصوتي لتوزيع 100 نانو لتر من المركبات في كل بئر من الأعمدة من 3 إلى 22 للحصول على تركيز نهائي يبلغ 40 ميكرومول. قم بتوزيع 100 نانولتر من DMSO في كل بئر من العمودين 1 و 23 كعناصر تحكم سلبية. قم بتوزيع 100 نانولتر من ببتيد HCN1 غير المسمى في كل بئر من الأعمدة 2 و 24 كعناصر تحكم إيجابية بتركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومول.

احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. باستخدام قارئ اللوحة ، قم بقياس الاستقطاب الفلوري. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الأطباق لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية قبل القراءة.

باستخدام المعادلة التالية ، احسب النسبة المئوية للتثبيط حيث XN هو النسبة المئوية الطبيعية للتثبيط المقابل للإشارة ، X.X الإيجابي هو متوسط الإشارة من آبار التحكم الإيجابية و X سالب هو متوسط الإشارة من آبار التحكم السلبية. للتحقق من صحة الزيارات التي تزيد عن 50٪ من التثبيط ، قم بإعداد مزيج رئيسي من 20 مل من 2 ميكرومولار TRIP8b و 50 نانومولار HCN1 TAMRA في المخزن المؤقت FP. قم بتوزيع 25 ميكرولترا من المزيج الرئيسي في كل بئر من صفيحة ميكروتيتر سوداء 384 بئر.

ثم أضف 100 نانولتر من المركبات من صفيحة تحتوي على تخفيفات تسلسلية مزدوجة لكل مركب نشط في الآبار المعنية. بالنسبة لآبار التحكم السلبية ، أضف 100 نانولتر من DMSO. للحصول على تحكم إيجابي ، أضف 100 نانولتر من ببتيد HCN1 المخفف بشكل متسلسل غير المسمى بتركيزات نهائية تتراوح من 200 ميكرومول إلى 0.1 ميكرومول.

احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، أو عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة. باستخدام قارئ اللوحة ، قم بقياس الاستقطاب الفلوري. احسب قيم IC50 عن طريق تركيب بيانات FP المعتمدة على التركيز لكل مركب باستخدام نموذج انحدار غير خطي مكون من 4 معلمات.

قم بإذابة جزء واحد من كل HIS الموسوم TRIP8b و GST الموسوم ببروتينات اندماج HCN1 واحتفظ بها على الجليد. قم بإعداد 1 مليلتر من 200 نانومولار HIS TRIP8b و 20 نانومول من GST-HCN1C40 في مخزن مؤقت للفحص لكل مركب يتم اختباره. استخدم ماصة ذات 16 قناة لإضافة 7 ميكرولترات من خليط HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 إلى ثلاثة آبار لكل صف من الصفوف من A إلى N لاختبار كل مركب في ثلاث نسخ.

بالطرد المركزي للوحة لفترة وجيزة للتأكد من أن السوائل في قاع كل بئر ، ولإزالة أي فقاعات. بعد ذلك ، قم بتوزيع مركبات Hit المراد اختبارها في اللوحة لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومول في الصف A والانتهاء من 0.1 ميكرومول في الصف L ، أضف نفس الحجم من DMSO في الصف M ، ثم قم بتوزيع ببتيد HCN1 غير المسمى إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومول في الصف N ، رج اللوحة لمدة دقيقتين واحتضانها لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام المخزن المؤقت للفحص ، قم بتخفيف حبات المستقبل المضادة لضريبة السلع والخدمات من 1 إلى 50.

باستخدام ماصة 16 قناة، أضف 3.5 ميكرولتر من حبات المستقبل المخففة إلى كل بئر من اللوحة واخلطها عن طريق سحب العينة برفق لتجنب تكوين فقاعات. احتضان الطبق في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. قم بتخفيف حبات المتبرع بمخلب النيكل من 1 إلى 50 باستخدام مخزن مؤقت للفحص مع عدم تعريض الخليط للضوء.

أضف 3.5 ميكرولتر من حبات المتبرع المخففة إلى كل بئر من الطبق واخلطها برفق ، وتجنب فقاعات الهواء. أغلق الطبق واحتضنه في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة. ثم استخدم قارئ اللوحة لقراءة اللوحة مع معلمات القياس المدرجة هنا.

أخيرا ، احسب قيم IC50 عن طريق تركيب البيانات لكل مركب باستخدام نموذج انحدار غير خطي مكون من 4 معلمات. لتقييم التفاعل مع HCN1 ، تم معايرة TRIP8b إلى تركيز ثابت من HCN1 TAMRA. يوضح هذا الرسم البياني أنه مع زيادة تركيز TRIP8b ، تصبح المزيد من جزيئات HCN1 TAMRA مرتبطة ويزداد الاستقطاب.

في هذه التجربة حيث تم معايرة HCN1 غير المسمى إلى تركيز ثابت من TRIP8b و HCN1 TAMA ، تم إزاحة الببتيد المسمى وانخفضت الإشارة. يظهر فحص الإنتاجية العالية نسبة تثبيط كل مركب ممثلة بنقاط مفردة على الرسم البياني. يتم رسم نتائج هذه الشاشة بعناصر تحكم إيجابية وسلبية ، ومتوسط تثبيط كل مركب عبر جولتين من المقايسة.

ثم تم التحقق من صحة المركبات التي تظهر تثبيط أكبر من 50٪ في هذه التجربة. تم تحديد إحداثيات X و Y من خلال النسبة المئوية للتثبيط في جولتين من الفحص. في هذه التجربة، يحتوي HCN1C40 على علامة ضريبة السلع والخدمات الطرفية التي تربط حبات المتقبل.

يثير تفاعل مجالات TPR ل TRIP8b وثلاثي الببتيد الطرفي C ل HCN1 حبة المانحة بضوء بطول موجي 680 نانومتر لإنتاج الأكسجين الفردي. أخيرا ، كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، أدى معايرة التركيزات المتزايدة للمركب المصاب NUCC-5953 إلى تركيز ثابت من TRIP8b و HCN1C40 إلى زيادة تثبيط تفاعل TRIP8b HCN1. قبل البدء في فحص الإنتاجية العالية ، تحقق من صحة تحضير البروتين والاستقطاب الفلوري في فحوصات القرب القائمة على الخرز.

تأكد من أن البروتين عالي النقاء. تناول البروتين لتجنب دورات الذوبان المتعددة بالتجميد. من المهم استخدام كواشف عالية الجودة ، بما في ذلك DMSO و Triton الطازجة.

لا تنس أن العمل مع DMSO يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية وقياس التدفق الخلوي من أجل تحديد ما إذا كانت المركبات الضاربة لها نشاط في الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء شاشة عالية الإنتاجية باستخدام مقايسة قائمة على الاستقطاب الفلوري.