أدوات لدراسة دور HMGB1 البروتين المعماري في تجهيز اللولب تشويه، والحمض النووي الخاصة بالموقع Interstrand Crosslinks

الهدف العام من تجارب الترسيب المناعي للكروماتين المعدل والالتفاف الفائق للحمض النووي هو دراسة الارتباط والتعديلات الطوبولوجية اللاحقة التي تسببها البروتينات المعمارية على تلف الحمض النووي الخاص بالموقع الناجم عن عوامل العلاج الكيميائي أو المسرطنة في الخلايا البشرية. ستسمح لنا هذه المنهجية بمعالجة الأسئلة الرئيسية حول تلف الحمض النووي وإصلاحه ، مما يسهل اكتشاف أهداف دوائية جديدة لعلاج السرطان. تسمح لنا تقنيتنا بتوجيه تلف الحمض النووي الخاص بالموقع ، وتسهل تقييم عمليات إصلاح الحمض النووي الحرجة ذات الصلة بالسرطان البشري.

للبدء ، قبل 24 ساعة من التعدي ، لوحة 400 ، 000 خلية ثدييات لكل طبق 60 ملم في DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS بدون مضادات حيوية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مليلتر ، امزج 30 ميكرولترا من عامل الإرسال بدرجة حرارة الغرفة مع 500 ميكرولتر من وسط النمو 1X الذي تم تسخينه إلى 37 درجة مئوية.

في الأنبوب الثاني ، امزج ميكروغرامين من البلازميدات المحتوية على ICL الموجهة ب TFO في 500 ميكرولتر من وسط النمو 1X. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. يمزج المزيج مع المزيج الاثنين، والماصة لأعلى ولأسفل لخلطها جيدا.

ثم احتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك ، استخدم PBS الدافئ لغسل الخلايا مرتين. بعد ذلك ، أضف مزيج التعداء بطريقة قطرية ، ووزع المحلول بالتساوي في جميع أنحاء لوحة الخلايا.

أضف ملليلترا واحدا من وسط النمو إلى الطبق ، واجعل الحجم النهائي إلى ملليلترين. تخلط جيدا وتوضع أطباق الاستزراع على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد أربع ساعات ، استبدل الوسط بثلاثة ملليلتر من وسط النمو بنسبة 10٪ FBS ، واحتضن 16 ساعة إضافية.

بعد الحضانة ، أضف 80 ميكرولترا من الفورمالديهايد الطازج بنسبة 37٪ لكل طبق إلى الخلايا ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق. قم بإخماد الارتباط المتقاطع للفورمالديهايد عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من الجلايسين المبرد لكل طبق ، واحتضانه لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة الوسيط ، واستخدم PBS المبرد لغسل الأطباق مرتين.

بعد ذلك ، بعد إضافة ملليمتر واحد من PBS المبرد ، اجمع الخلايا عن طريق كشط أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد ، مع الاحتفاظ بالعينات على الجليد في جميع الأوقات. تحضير كريات الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 13, 400 مرة G, وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية ، ووضع الكريات على الثلج.

استخدم ملليلترا واحدا من العازلة المبردة أ لإعادة تعليق الكريات بشكل متجانس ، واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم ، قم بتكسير الخلايا كما كان من قبل. الآن ، باستخدام مليلتر واحد من Buffer B المبرد ، أعد تعليق الكريات بشكل متجانس ، واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق مع الخلط العرضي عن طريق قلبها.

ثم تكسير الخلايا كما كان من قبل. بعد إعادة تعليق الخلايا مرة أخرى ، في 200 ميكرولتر من العازلة B المبردة ، أضف ميكرولترين من نوكلياز المكورات الدقيقة ، أو MNase ، واحتضن التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أوقف تفاعل MNase عن طريق وضع الأنابيب على الجليد ، وإضافة 40 مللي مولار EDTA.

يعد مستوى الهضم بواسطة نوكلياز المكورات الدقيقة أمرا بالغ الأهمية ، لأن فرط الهضم قد يتسبب في فقدان الإشارة ، في حين أن سوء الهضم قد يسبب الكثير من الخلفية غير المحددة. بعد تكوير الخلايا ، أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من الترسيب المناعي للكروماتين ، أو المخزن المؤقت ChIP ، المكملة بكوكتيل مثبط للبروتين. ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق رقيق الجدران.

قم بتحريك العينات عن طريق تعويمها على جهاز صوتي حمام مائي لمدة 20 ثانية ، متبوعا ب 20 ثانية على الجليد. كرر خطوات الصوتنة تسع مرات لتوليد ما يقرب من 800 إلى 1 ، 200 جزء زوج أساسي. إلى 20 ميكرولترا من العينات الصوتية ، أضف ثلاثة ميكرولترات من خمسة كلوريد الصوديوم المولي ، وميكرولتر واحد من RNase A.Vortex الأنابيب ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم أضف ميكرولترين من البروتيناز K ، واحتضنه عند 65 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد تنقية العينات ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتشغيلها على 1٪ جل الاغاروز ، وتصورها باستخدام بروميد الإيثيديوم. في ثلاثة أنابيب منفصلة من السيليكون المبردة مسبقا ، أضف 30 ميكرولترا من المحللات ، و 70 ميكرولترا من المخزن المؤقت 1X ChIP المبرد مع مثبطات البروتياز المضافة.

أضف ميكروغراما واحدا من الأجسام المضادة ل IgG أو الهيستون H3 أو الأجسام المضادة ل HMGB1 إلى الأنابيب المعنية. احتضن طوال الليل في غرفة باردة مع دوران مستمر. في الغرفة الباردة ، بعد إعادة تعليق حبات البروتين G ، أضف أربعة ميكرولترات من الخرزات إلى كل أنبوب تفاعل ، واحتضن في غرفة باردة مع الدوران لمدة ساعتين إلى أربع ساعات أخرى.

ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لحبيبات الخرز وإزالة المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من 1X ChIP المؤقت مع كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني إلى الكريات ، واغسلها في البرد بالتناوب لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، مع المحلول العلوي 1X ChIP ، قم بإجراء غسيل إضافي.

بعد ذلك ، استخدم 160 ميكرولتر من محلول الشطف لإعادة تعليق الكريات ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع الدوران لمدة 30 دقيقة. بيليه الخرز ، وجمع المادة الطافية في أنبوب جديد. أضف ستة ميكرولترات من خمسة مولي كلوريد الصوديوم ، وميكرولترين من البروتيناز K ، واحتضانها طوال الليل عند 65 درجة مئوية.

بعد تنقية الحمض النووي ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعات التمهيدي للمنطقة أو المناطق ذات الأهمية ، وحل المنتجات على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ ، ملطخ ببروميد الإيثيديوم. قبل الاستخدام ، قم بإذابة الجليد مسبقا من المخزن المؤقت لإصلاح الحمض النووي على الجليد ، وأضف 40 مللي مولار من الفوسفوكرياتين ، و 2.5 ميكروغرام من الكرياتين فوسفوكيناز. بعد تحضير المخزن المؤقت الفائق الالتفاف 10X ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ميكرولتر واحدا من اللقاح توبويزوميراز 1 مع 1X الملف الفائق في تفاعل 10 ميكرولتر لخطية 300 نانوجرام من البلازميد فائق الالتفاف ، PCA FG1.

إلى البلازميدات المريحة ، أضف 25 ميكرولترا من مستخلص خلايا HeLa المذاب حديثا ، ومخزن تخليق الحمض النووي. اخلطي جيدا ، ثم أضيفي ميكرولتر واحد من اللقاح توبويزوميراز 1 إلى التفاعل ، واحتضنيه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإنهاء التفاعلات بإضافة 1٪ SDS و 0.25 ملليغرام لكل ملليلتر من البروتيناز K ، واحتضانه عند 65 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد صب هلام الاغاروز بنسبة 1٪ مع مخزن مؤقت 1X TPE ، أضف صبغة تحميل الحمض النووي إلى التفاعلات ، وقم بتحميل العينات مباشرة على الجل على بعد أربعة حارات على الأقل. قم بتشغيل الجل لمدة ثماني إلى 10 ساعات بجهد فولت لكل سنتيمتر في 1X TBE للبعد الأول في درجة حرارة الغرفة لحل التوبوزوميرات. تحضير لترين من 1X TBE مع ثلاثة ميكروغرام لكل مليلتر من فوسفات الكلوروكين.

انقع الجل في 200 مل من المحلول ، مغطى بورق الألمنيوم لمدة 20 دقيقة. لتفريغ الجل كهربائيا في البعد الثاني ، قم بتدوير الجل 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة ، وقم بتشغيله لمدة أربع إلى ست ساعات بجهد فولت لكل سنتيمتر في الكلوروكين الذي يحتوي على 1X TBE لحل اللفائف الفائقة الموجبة والسالبة. تعتبر كمية الكلوروكين في المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي ، وفي الهلام ، أمرا بالغ الأهمية ، بالإضافة إلى تشغيل الجل بجهد منخفض جدا للبعد الثاني أمر بالغ الأهمية لفصل الملفات الفائقة الموجبة والسالبة.

بعد تلطيخ الجل وإزالة البقع ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم جهاز تصوير لتصور التوزيع الحراري للتوبويزومتر. كما هو موضح في هذا الجل ، فإن ما يقرب من 79٪ من البلازميدات التي تحتوي على ICLs موجهة TFO تهاجر بحركة أبطأ عبر مصفوفة هلام الاغاروز عند مقارنتها ببلازميدات التحكم غير المتقاطعة. تظهر فحوصات ChIP التي يتم إجراؤها على المحللات من خلايا U2OS البشرية المنقولة إما ببلازميد التحكم أو البلازميدات التي تحتوي على ICLs موجهة من TFO إثراء HMGB1 في منطقة P-ICL مقارنة بمنطقة التحكم عند ترسيبها المناعية بالجسم المضاد ل HMGB1.

عندما تم استنفاد HMGB1 من الخلايا عن طريق علاج siRNA ، تم تضاؤل التخصيب الخاص ب P-ICL. عندما تم ترسيب نفس العينات المناعية باستخدام جسم مضاد مضاد ل IgG ، تم الكشف عن الحد الأدنى من تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أخيرا ، في هذا الشكل ، يوضح الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد التعديل المعماري للبلازميدات المحتوية على ICL الموجهة ب TFO كالتفاف فائق سالب بواسطة HMGB1 في مستخلصات خلايا HeLa.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمسة أيام تقريبا ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا أن تتذكر أن جميع عمليات الغسيل يجب أن تتم في الغرفة الباردة ، لأن الغسيل بدرجة حرارة الغرفة قد يزيد من إشارة الخلفية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل استنفاد البروتين بوساطة siRNA ، متبوعا بمقايسات فحص الطفرات ، من أجل الإجابة على أسئلة ، مثل ، هل البروتين المعني متورط في إصلاح الحمض النووي؟

أم أنه يغير بشكل كبير أطياف الطفرات أثناء العملية؟ مهدت هذه التقنية الطريق لدراسة الارتباط بين البروتينات وتلف الحمض النووي الخاص بالموقع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية دراسة ارتباط البروتينات المعمارية لاستهداف الروابط المتقاطعة للحمض النووي ، وبالتالي تحديد تأثير هذا الارتباط على طوبولوجيا الحمض النووي.

لا تنس أن العمل مع بروميد الإيثيديوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وبالتالي ، يجب دائما ارتداء معدات الحماية المناسبة أثناء إجراء هذه التجربة.