تقنية جديدة لتوليد ومراقبة التوهج في إعداد البيولوجي

الهدف العام لهذا البروتوكول هو تقديم تقنية تصوير كيميائية جديدة قبل السريرية ، وبين العمليات الجراحية ، والتي يمكن أن توفر فوائد على التقنيات البصرية الحالية من حيث نسب الإشارة إلى الضوضاء وحدود الكشف. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية التي لم تكن متاحة من خلال تقنيات التصوير البصري التقليدية في العديد من المجالات المتعلقة بالعلوم البيولوجية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تحتوي على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية وأنها لا تتطلب ضوءا فوريا ولا إشعاعا.

لذا فإن ما وجدناه هو أن الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد حقا نحو التصوير بين العمليات الجراحية لحالات مرضية متعددة بما في ذلك السرطان بسبب نسب الإشارة إلى الضوضاء العالية التي تقدمها هذه التقنية. نظرا لأن الضوء الساقط غير ضروري لهذه التقنية ، فلا توجد مشاكل في امتصاص الضوء الساقط. علاوة على ذلك ، هناك صندوق أدوات كيميائي كبير متاح لتشغيل جزيء النواة الكيميائية.

لبدء الإجراء ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من محلول قياسي من كلوريد تريس (بايبيريدين) الروثينيوم (II) في ماء التناضح العكسي. بعد ذلك ، اجمع كل معيار مع 100 ميكرولتر من محلول 25 ملليمولار من نترات سيريوم الأمونيوم في ماء التناضح العكسي على شريحة مجهرية. افتح برنامج تصوير قارئ التلألؤ الحيوي وانقر فوق تهيئة.

في وضع التصوير ، تأكد من فحص الإنارة والصورة وعدم التحقق من الفلورسنت. اضبط وقت التعرض للإضاءة ، والتجميع ، و f / stop ، ومعلمات مرشح الانبعاث. اضبط وقت التعرض للصورة الفوتوغرافية ومعلمات التجميع وf/stop.

ثم اضبط ارتفاع الموضوع وفقا للعينة المراد تصويرها. اضبط مجال الرؤية على B لمسافة 14 سم بين الكاميرا ومرحلة العينة. قم بتغطية أرضية غرفة تصوير قارئ التلألؤ الحيوي في مرحلة العينة بورق بناء أسود.

ثم ضع الشريحة الأولى مع قطرة الخليط القياسي على مرحلة العينة مع توسيط القطرة في خط التصويب الأخضر لصندوق الضوء. بعد ذلك ، املأ زجاجة الرش سعة ثلاثة أونصات من البخاخات المصممة خصيصا بمحلول 1: 3 من ثلاثي إيثيل أمين في محلول 50/50 من الماء والإيثانول. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في أنبوب الشفط.

ضع مجموعة البخاخات في غرفة التصوير مع توجيه فوهة الرش نحو القطرة المراد تصويرها دون إعاقة رؤية الكاميرا للقطرة. تأكد من تشغيل مفتاح طاقة البخاخات ومؤشر الطاقة ، وإيقاف تشغيل مفتاح التبديل المغناطيسي وعدم تشابك بخاخات الطاقة والأسلاك عن بعد. قم بتغطية النقاط الساخنة مثل العلامات الموجودة على الشريحة بقطع صغيرة من ورق البناء الأسود.

ضع ما لا يقل عن 40 سم من سلك البخاخات عن بعد في غرفة التصوير. أغلق باب الغرفة برفق دون تجعيد أسلاك البخاخات. في برنامج الأداة ، انقر فوق الحصول ، وقم بتمكين الحفظ التلقائي وتعيين مسار ملف البيانات.

بدء تسلسل التصوير. عندما يفتح الغالق بنقرة مسموعة ، قم بتبديل البخاخات ثلاث مرات لرش ثلاث دفعات من محلول ثلاثي إيثيل أمين على العينة. كرر الإجراء مع كل شريحة قياسية لتحديد الحد الأدنى للتركيز القابل للاكتشاف لعامل تصوير الروثينيوم.

لبدء إجراء التصوير في الجسم الحي ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من محلول يحتوي على ما بين 8 و 33 نانومول من كلوريد تريس (بايبيريدين) الروثينيوم (II) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات. تحضير محلول مائي 25 ملليمولار من نترات الأمونيوم سيريوم. بعد ذلك ، قم بحقن 100 ميكرولتر من عامل تصوير الروثينيوم في وريد الذيل للفئران السليمة.

التضحية بالفئران بعد 10 دقائق من الحقن عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة الجلد من الجذع بقطع Y ثم قم بإزالة القوس الساحلي لكشف القلب والرئتين. اقطع منفذا في الأذين الأيمن وحقن 20 مل من PBS من خلال إبرة قياس 24 في البطين الأيسر.

قطع جلد البطن لكشف الكلى والكبد. إذا كان العضو محل الاهتمام هو الكبد أو الكلى أو الطحال ، فقم بعمل قطع طولي مرئي عبر العضو. قم بإعداد تسلسل تصوير جديد في برنامج قارئ الإضاءة الحيوية.

لتصوير البطن بالكامل ، ضع الماوس في غرفة التصوير بحيث يكون البطن المفتوح مواجها للكاميرا والرأس متجها نحو الجزء الخلفي من الجهاز. قم بتوسيط العضو محل الاهتمام في خط الشعر المتقاطع لصندوق الضوء الأخضر. اغسل زجاجة الرش والفوهة جيدا من مجموعة البخاخات ثم املأ الزجاجة بمحلول نترات السيريوم الأمونيوم.

ضع البخاخات في غرفة التصوير مع توجيه فوهة الرش إلى موقع التصوير. تأكد من أن الكاميرا خالية من العوائق ، وأن الحبال غير متشابكة وأن ما لا يقل عن 40 سم من السلك البعيد في الغرفة. أغلق الغرفة وابدأ تسلسل التصوير.

عندما يفتح الغالق بنقرة واحدة ، قم بتبديل مفتاح التبديل ثلاث مرات لرش ثلاث رشقات من العامل المؤكسد على موقع التصوير. بعد التصوير ، قم بإزالة مجموعة البخاخات واشطف فوهة الرش جيدا لمنع تبلور نترات السيريوم الأمونيوم. لتصوير الأعضاء الفردية اللاحقة والقياس الكمي ، قم بإزالة الماوس من الجهاز واستئصال الأعضاء الداخلية بدءا من تجويف الجسم المفتوح.

قطع جلد الساق الخلفية لاستئصال عينات الأنسجة العضلية. إذا كان العضو محل الاهتمام هو الكبد أو الكلى أو الطحال ، فقم بقطع العضو إلى نصفين طوليا. ثم ضع العضو على طبق بتري أو قطعة من ورق البناء الأسود.

قم بتصوير كل عضو بنفس طريقة بأكمله ، واشطف فوهة الرش بعد كل تسلسل. في هذا الإجراء ، تم حقن الفئران بعامل تصوير قائم على الروثينيوم ورش الأنسجة ذات الأهمية بمؤكسد للحث على التلألؤ الكيميائي. تم تحديد الحد الأدنى للتركيز القابل للاكتشاف لعامل التصوير ليكون 6.9 بيكومول لكل سنتيمتر مربع في هذه الظروف.

الحصول على التلألؤ الكيميائي في صور الضوء الأبيض للأعضاء ذات الأهمية باستخدام قارئ التلألؤ البيولوجي. لوحظت إشارة التلألؤ الكيميائي في الغالب في الكلى بعد الحقن الوريدي مما يشير إلى القضاء الكلوي على كاتيون تريس (بايبيريدين) الروثينيوم (II) المحبة للماء. كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء لعامل التصوير مقابل PBS وحده 27: 1 في الكلى و 21: 1 في الكبد.

تم تقييم الغدد الليمفاوية المأبضية للفأر أيضا بالحقن تحت الجلد لمحلول أكثر تركيزا لعامل التصوير القائم على الروثينيوم. أظهرت الغدد الليمفاوية التي تحتوي على عامل التصوير إشراقا أكبر بكثير من الغدد الليمفاوية التي تحتوي على PBS وحدها. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استبعاد الضوء المحيط وتجنب التلوث بالروثينيوم tris bpy. بعد تطويرها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التصوير الجزيئي الحيوي لاستكشاف حالات المرض مثل السرطان في الفئران. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للأسئلة التي لم يكن من الممكن الوصول إليها بواسطة تقنيات التصوير البصري التقليدية ، إلا أن أي سؤال يمكن التحقيق فيه باستخدام التقنيات التقليدية يمكن معالجته باستخدام التلألؤ الكيميائي.