التصوير من التعديلات خلية الشكل والحركة الخلية في ذبابة الفاكهة المعيدة عن طريق DE-كادهيرين مراسل الذباب المعدلة وراثيا
ديسمبر 29, 2016
هنا نصف إجراء لالتقاط صور حية لذبابة الفاكهة المعدة. وقد مكننا هذا من فهم الانقباض القمي الذي ينطوي عليه التطور المبكر بشكل أفضل وتحليل الآليات التي تحكم الحركات الخلوية أثناء تعديل بنية الأنسجة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو فهم الشكل الخلوي وحركته بشكل أفضل أثناء ذبابة الفاكهة المعدة. نقدم هنا طريقة قياس قوية لذبابة الفاكهة المعدة ، لفحص بدء الحركة الخلوية المورفولوجية ، خلال هذه المرحلة من التطور الجنيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحديد إعادة ترتيب الخلايا في وقت المعدة جنبا إلى جنب مع الانقباض القمي أثناء المعدة
لبدء التجربة ، قم بإعداد خليط من 375 مل من الماء. 125 مل 100٪ عصير تفاح متاح تجاريا. 12.5 غرام من أجار.
12.5 جرام من الجلوكوز. بعد ذلك ، سخني الخليط في الميكروويف حتى يذوب الأجار. واسكبه في طبق ثقافة الخلايا بطول ثلاثة سنتيمترات.
قم بتخزين الخليط على حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه في المستقبل. بعد تحضير طبق التفاح ، أضيفي طبقة رقيقة من معجون الخميرة المعجن فوقه للسماح للذباب بوضع البيض. ضع 25 ذبابا ذكرا و 25 ذبابة في زجاجة على طبق تفاح مغطى بالخميرة المعجنة.
لف زجاجات ذبابة الفاكهة البلاستيكية بورق الألمنيوم لحث الذباب على وضع المزيد من البيض. احتفظ بالزجاجة رأسا على عقب في حاضنة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، استبدل طبق عصير التفاح بطبق جديد.
ثم لف الزجاجة بورق الألمنيوم واترك الذباب يضع البيض لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. بعد أن يضع الذباب البيض ، قم بفك البيض من الطبق باستخدام برعم قطني. اجمع الأجنة في مصفاة ، واغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS.
اغسل الأجنة ثلاث مرات أخرى باستخدام PBS ، في أطباق استزراع 12 بئر. قم بإزالة الأجنة باستخدام 50٪ من المبيض ، في أطباق ثقافة 12 بئر. بعد عملية التفكيك ، اغسل الأجنة ثلاث مرات أخرى باستخدام PBS.
انقل الأجنة إلى طبق ثقافة خلية يبلغ طوله ثلاثة سنتيمترات يحتوي على PBS. وحدد المرحلة الخامسة من الأجنة تحت المجهر ، بناء على مستوى الشفافية على حدودها. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، اجمع الأجنة المرحلية.
بعد ذلك ، ضع جنينين محددين على زلة غطاء زجاجي ، وقم بإزالة PBS الزائد باستخدام المناديل الورقية. باستخدام مناديل ورقية ملتوية بدقة ، قم بتوجيه الجانب الظهري للأجنة لأعلى إلى زلة الغطاء. ثم قم بتوصيل الأجنة بزلة الغطاء الزجاجي بشحم السيليكون باستخدام إبرة دقيقة.
أضف قطرة صغيرة من زيت الكربون المجوف 700 على الأجنة ، وضع الغطاء الذي يحتوي على الأجنة رأسا على عقب على الشريحة ذات المسافة البادئة. ترك بعض المساحة في الجزء السفلي من الشريحة. ثم قم بلصق زلة الغطاء على الشريحة.
أخيرا ، افحص الأجنة باستخدام نظام تصوير متحد البؤر ، وليزر الأرجون 488 ، وهدف غمر الزيت. تم التقاط صور الفاصل الزمني من التصوير الحي ، باستخدام DE-cadherin GFP لحركة الخلية على مدى 500 ثانية ، لتحليل المناطق القمية للخلايا الفردية ، ذبابة الفاكهة أثناء المعدة في 500 ثانية ، يكون الانقباض القمي والغزو مرئيا بوضوح.
باستخدام طريقتنا. يمكننا أن نفهم بشكل أكبر ، الآليات الجزيئية لذبابة الفاكهة المعدة ، وكذلك الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة ، المتورطة في ورم خبيث سرطاني.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة إجراءً لالتقاط صور حية لعملية تكوين الجنين في ذبابة Drosophila، مما يعزز فهمنا للتضيق القمي خلال مراحل النمو المبكرة. تتيح هذه التقنية تحليلاً مفصلاً للحركات الخلوية المشاركة في تعديل بنية الأنسجة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- علم الأحياء الخلوي
خلفية علمية
- تعد عملية تعرُّق ذبابة الفاكهة (Drosophila) مرحلة حاسمة في التطور الجنيني.
- يعد فهم شكل الخلايا وحركتها أمراً ضرورياً لاستيعاب العمليات التطورية.
- يلعب التضييق القمي دوراً هاماً في الحركات المورفوجينية.
- يمكن لتقنيات التصوير الحي أن توفر رؤى حول السلوكات الخلوية الديناميكية.
الغرض من الدراسة
- لتحسين فهم الحركات الخلوية أثناء عملية التكوين الجنيني في ذبابة Drosophila.
- لتطوير طريقة قوية لقياس الحركة الخلوية المورفوجينية.
- لتحديد إعادة ترتيب الخلايا والتضيق القمي أثناء عملية التكوين الجنيني.
الطرق المستخدمة
- تحضير خليط محدد للتصوير.
- التصوير الحي لأجنة Drosophila أثناء عملية التكون المعوي.
- تحليل الحركات الخلوية وتغيرات الشكل.
- تحديد الأحداث المورفوجينية الرئيسية.
النتائج الرئيسية
- الالتقاط الناجح لصور حية لعملية الت gastrulation في ذبابة Drosophila.
- تحديد التضيق القمي (apical constriction) وإعادة ترتيب الخلايا.
- تعزيز فهم الديناميكيات الخلوية خلال مراحل التطور المبكرة.
- منهجية قوية للدراسات المستقبلية في بيولوجيا التطور.
الاستنتاجات
- يوفر هذا الإجراء رؤى قيمة حول عملية تكوين المعيد في Drosophila.
- يعد التصوير الحي أداة قوية لدراسة الحركات الخلوية.
- تساهم هذه النتائج في تعميق الفهم العام للعمليات النمائية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر التصوير الحي لتغير شكل الخلايا وحركتها أثناء عملية التكون المعوي في ذبابة Drosophila منصة قوية لتحليل الآليات الجزيئية الكامنة وراء التحول الظهاري الميزنكيمي (EMT)، وهي عملية مرتبطة بالتليف والانتشار السرطاني. تتيح هذه الطريقة تصوراً عالي الدقة للتضيق القمي وإعادة ترتيب الخلايا، مما يعزز الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة للمسارات المرتبطة بالتحول الظهاري الميزنكيمي. كما يعزز هذا النهج الاستمرارية الانتقالية من علم الأحياء التنموي إلى الدراسات الميكانيكية ذات الصلة بالأمراض في مجال البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استجواب وظائف الجينات المرتبطة بالتحول الظهاري الميزنشيمي (EMT) وديناميكيات المسارات في سياق حي متعدد الخلايا.
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال التصوير المباشر للأحداث المورفوجينية المرتبطة بآليات المرض.
- يسهل التحقق الوظيفي من الأهداف للجينات التي تتحكم في التضيق القمي وانتقالات مصير الخلية.
- يوفر ثقة تنبؤية لتحديد أولويات الأهداف المعدلة للتحول الظهاري الميزنشيمي (EMT) في محافظ أبحاث الأورام والتليف.
الفحص وتطوير المقايسة
- يؤسس نظام تصوير تم التحقق من صحته لقياس حركة الخلايا وتغيرات شكلها في الوقت الفعلي.
- يمكّن من القياس القابل للتكرار للتضيق القمي وإعادة ترتيب الخلايا كمخرجات مقايسة كمية.
- يدعم توحيد منصات الفحص المظهري للمركبات التي تعدل عملية الانتقال الظهاري الميزنشيمي (EMT).
- يجهز أنظمة بيولوجية قوية لسير عمل الفحص عالي المحتوى في المراحل اللاحقة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط عمليات الانتقال الظهاري الميزنشيمي (EMT) التنموية بنماذج ذات صلة بالمرض من حيث النقيلة وإعادة تشكيل الأنسجة.
- يوفر رؤى ميكانيكية تساعد في اختيار المؤشرات الحيوية الانتقالية للدراسات قبل السريرية.
- يتيح دفع المرشحين المستهدفين لعملية EMT بشكل معدل حسب المخاطر بناءً على أدلة مظهرية من الخلايا الحية.
- يعزز الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري في المجالات المرضية التي يقودها الانتقال الظهاري الميزنشيمي (EMT).
تكامل سير العمل والمسار التحليلي
تتكامل طريقة التصوير هذه ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من اختبار الفرضيات المبكرة وصولاً إلى تطوير النماذج قبل السريرية للأهداف المرتبطة بالانتقال الظهاري الميزنكيمي (EMT).
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات الخاصة بالتحول الظهاري المتوسط (EMT) ومنظمات التخلق الشكلي.
- الفحص: يوفر مخرجات كمية وقابلة للتكرار لشكل الخلايا وحركتها، مما يمهد الطريق لجاهزية المقايسة.
- التحليلات: يوفر بيانات تصوير عالية المحتوى للتحليل المقارن للاضطرابات الجينية أو الدوائية.
- الأبحاث الترجمية: يربط الآليات التطورية بنماذج التحول الظهاري المتوسط (EMT) ذات الصلة بالأمراض لمواءمة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يوفر منصة تصوير قابلة لإعادة الاستخدام وقابلة للتكيف مع دراسات متنوعة في التحول الظهاري المتوسط (EMT) والتخلق الشكلي.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية والحد من المخاطر الميكانيكية لبرامج الاكتشاف التي تستهدف الانتقال الظهاري المتوسط (EMT).
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل تصويري موحد وقابل للتوسع لضمان إمكانية إعادة الإنتاج عبر المشاريع المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم اتخاذ قرارات الاستمرار أو التوقف (go/no-go) وتقلل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من المؤشرات المرضية التي يحركها الانتقال الظهاري المتوسط (EMT).
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للأصول التي تعدل الانتقال الظهاري المتوسط (EMT) عبر المجالات العلاجية المختلفة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التصوير الحي، والمجهر البؤري (confocal microscopy)، وعلم أجنة ذبابة Drosophila.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة تصوير متقدمة وبرمجيات تحليلية لتحليل الفواصل الزمنية (time-lapse analysis).
- يقتضي توحيد معايير تحديد مراحل الجنين وبروتوكولات التصوير بين الفرق لضمان إمكانية تكرار النتائج.
- قد يتطلب التكيف مع أنظمة نماذج أخرى تحسيناً لبنى المراسل (reporter constructs) وظروف التصوير.
- تشمل القيود العملية قيود الإنتاجية والحاجة إلى تعامل دقيق مع الأجنة.
