التنمية وتحديد جزء من السكان رواية من المستمدة العدلات-الإنسان البالعات العملاق في المختبر

تتمثل الأهداف العامة لهذه الطريقة في توليد وتحديد الخلايا البلعمية العملاقة المستزرعة في المختبر المشتقة من العدلات البشرية المنتشرة للتحقيق في دورها في الاستجابات المناعية الالتهابية والمضادة للالتهابات. يمكن استخدام هذه الطريقة للحصول على مجموعة فرعية جديدة من الخلايا البلعمية العملاقة وتحديدها والتي تتطور من العدلات البشرية للحفاظ على ظروف الاستزراع طويلة الأمد. يمكن استخدام هذه التقنية لمزيد من التحقيق في أهمية ووظائف الخلايا البلعمية العملاقة وكذلك للإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تنشيطها ومرونةها.

ستظهر الإجراء إيفا ليدر ، مساعدة الباحثين لدينا ، وأوكسانا روغوفوي ، ما بعد الدكتوراه ، وكلاهما من مختبري. استخدم مجموعة وريد فروة الرأس المعقمة للحصول على ما لا يقل عن 40 مل من الدم الوريدي من متطوع شاب سليم. ثم امزج الدم برفق في غطاء التدفق الصفحي للسلامة الحيوية.

قم بتخفيف 10 إلى 12 مليلتر من عينة الدم الكاملة إلى حجم نهائي قدره 24 مل مع PBS خال من الأيونات الدافئ مسبقا والذي يحتوي على 2٪ FCS معطل للحرارة. ثم أضف 12٪ ملليلتر من البولي سكروز 1119 إلى قاع أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم من مادة البولي بروبيلين معقمة سعة 50 ملليلترا لكل عينة دم ، متبوعا بطبقات دقيقة من 12 مل من البولي سكروز 1077 فوق محلول التدرج متعدد السكروز 1119. قم بتقطيع 24 مل من الدم المخفف بعناية على أنابيب فردية من محاليل تدرج الكثافة وفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

يجب ملاحظة طبقتين غير شفافتين ناتجتين. تخلص من السائل حتى 0.5 سم فوق طبقة الخلية أحادية النواة في كل أنبوب. ثم انقل الخلايا أحادية النواة من كل عينة إلى أنبوب جديد واحد.

بعد ذلك ، تخلص من السائل المتبقي حتى 0.5 سم فوق الخلية متعددة الأشكال أو طبقة PMN وانقل PMNs من كل عينة إلى أنبوب جديد مختلف. اغسل PMNs في حجم نهائي قدره 30 مل من PBS يحتوي على 2٪ FCS معطل بالحرارة متبوعا بتحلل خلايا الدم الحمراء بثلاثة ملليلتر من كلوريد الصوديوم المنخفض التوتر المثلج المعقم 0.2٪. بعد 30 ثانية على الجليد ، استعد تساوي التوتر بثلاثة ملليلتر من كلوريد الصوديوم المعقم البارد.

ثم أضف ستة ملليلتر من 37 درجة مئوية RPMI 1640 متوسط مكمل ب FCS معطل بالحرارة وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من RPMI 1640 مكملة ب 10٪ FCS معطل للحرارة. بعد العد ، اضبط التركيز على 1.25 إلى 1.5 في 10 إلى السادس PMN لكل مليلتر من وسط الثقافة وقم بلوحة واحدة من الخلايا لكل بئر في آبار فردية من صفيحة 24 بئرا.

ثم ضع اللوحة في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية ، وقم بتغذية المزارع عن طريق الاستبدال اللطيف لنصف الوسط ب RPMI 1640 Medium طازج مكمل ب 10٪ FCS معطل بالحرارة كل ثلاثة أيام. سوف تتمايز العدلات إلى خلايا بلعمة عملاقة في غضون سبعة أيام من الزراعة. في اليوم السابع من الثقافة ، قم بإزالة نصف الوسط بعناية من كل بئر.

ثم قم بعمل ماصة الوسط المتبقي بقوة لإزالة الخلايا البلعمية العملاقة الملتصقة قليلا. انقل الخلايا المنفصلة من بئرين إلى أربعة آبار من كل مجموعة معالجة إلى أنابيب مخروطية فردية مقاس 15 ملم وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليق الكريات في 100 إلى 120 ميكرولتر من الوسط لكل أنبوب. ثم قم بتجهيز اثنين إلى ثلاثة حاملين لكل مجموعة علاج بشرائح المجهر وبطاقات الترشيح ومسارات التحويل.

بعد ذلك ، أضف الحجم الكامل للخلايا من كل أنبوب إلى قمع Cytospin المناسب. ثم قم بتحميل الحوامل على Cytospin وقم بتدوير الخلايا على الشرائح. جفف الشرائح المغزولة لمدة 10 دقائق.

ثم استخدم علامة مستقرة للماء لرسم حاجز كاره للماء حول الخلايا وإصلاح العينات بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد تحت غطاء كيميائي في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق ، اشطف الشرائح لفترة وجيزة ثلاث مرات بحوالي 100 ميكرولتر من PBS لكل غسلة. ثم قم باختراق الخلايا باستخدام 0.5٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة متبوعة بخمس غسلات PBS كما هو موضح للتو.

قم بمنع الارتباط غير المحدد بمصل الماعز العادي بنسبة 10٪ في RPMI 1640 Medium للفترة الزمنية المناسبة متبوعا بغسل PBS واحد. الآن ، أضف كمية صغيرة من الماء إلى الصندوق للحفاظ على الرطوبة ثم قم بتسمية الخلايا بحوالي 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المناسب المعني بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في غرفة مظلمة رطبة. بعد ذلك ، قم بإجراء غسل PBS واحد ثم أضف الجسم المضاد الثانوي المترافق الفلوري المناسب.

بعد 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء ، اغسل العينات لإزالة الجسم المضاد الزائد وقم بتركيب الشرائح بقطرة واحدة من وسط التثبيت لكل عينة وغطاء. قم بتحليل الشرائح عن طريق الفحص المجهري الفلوري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر في غضون 30 إلى 120 دقيقة تحت هدف زيت الظهور 40X. ثم احسب مساحة الخلية وشدة التألق والتوطين المشترك باستخدام البرنامج المناسب.

يمكن ملاحظة تطور العدلات إلى خلايا بلعمة عملاقة في غضون سبعة أيام من الثقافة في هذه الصور. يتضح البلعمة الذاتية في وقت مبكر يصل إلى 90 دقيقة بعد ثقافة العدلات مع بقع غشاء الفلورسنت مع قطر خلية متضخم بشكل كبير يظهر في الأيام من الرابع إلى السابع. ومع ذلك ، إذا تم استكمال مزارع العدلات ب GM-CSF و IL-4 ، فإن الخلايا تظهر قطرا أصغر بشكل عام وإسقاطات سيتوبلازمية تشبه الخلايا الشبيهة بالخلايا المتغصنة.

يكشف الفحص المجهري بفاصل زمني للخلايا البلعمية العملاقة في أيام الاستزراع من الثالث إلى الرابع والأيام من أربعة إلى خمسة عن أي خلايا أو خلايا ملتصقة بشكل طفيف ذات قدرة حركة محدودة تبتلع بنشاط بقايا العدلات المحيطة والحطام. في هذه الثقافة المختلطة للعدلات أحادية الخلية ، يمكن مقارنة هجرة البلاعم الزاحفة بنشاط بالحركة شبه الثابتة لخلية البلعمة العملاقة المسماة بالفلورسنت في نفس الثقافة جيدا. يمكن التحقق من الأصل العدلي للخلايا البلعمية العملاقة من خلال تعبيرها الإيجابي عن عدم وجود علامات عدلات وافتقارها إلى التعبير عن علامات الخلايا أحادية الخلية والتغصنية.

تولد الخلايا البلعمية العملاقة أيضا أنواعا من الأكسجين التفاعلي القاعدي وتستجيب لتحفيز الزيموزان و PMA عن طريق الانفجار التأكسدي. ومع ذلك ، على عكس الخلايا الوحيدة أو العدلات ، فإنها تستجيب أيضا عن طريق رشقات نارية مؤكسدة لتحفيز البروتين الدهني المؤكسد منخفض الكثافة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ستة إلى سبعة أيام.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استبدال نصف الوسط برفق عند تغذية مزارع العدلات. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تقنيات تلطيخ أخرى للإجابة على أسئلة حول الوظائف الإضافية لهذه الخلايا المثيرة للاهتمام في المختبر وكذلك في الجسم الحي. يمكن أن تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا العدلات لاستكشاف تنشيط العدلات واللدونة وتحديد هذه الخلايا في الجسم الحي في الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لدى البشر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على الخلايا البلعمية العملاقة والتعرف عليها في الثقافة. من فضلك لا تنس أن العمل بدم الإنسان يمكن أن يكون معديا وأن الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والتخلص من جميع السوائل واستخدام المعدات التي تستخدم لمرة واحدة في حاويات المخاطر البيولوجية المناسبة أمر لا بد منه عند تنفيذ هذا الإجراء.