تحليل الكروموسومات الزيغ الناجم عن المواد-المحيط الجسيمات باستخدام في المختبر النظام

الهدف العام من هذه التجربة هو الكشف عن تلف الكروموسومات الناجم عن تعرض الخلايا للجسيمات المستخرجة من الهواء المحيط. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي واحد في مجال الجسيمات ، وهو هل يؤدي التعرض للجسيمات إلى تلف الكروموسومات؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصور المباشر للضرر الناجم عن المادة الوراثية.

بعد جمع الجسيمات وتحليلها وفقا لبروتوكول النص ، قم بإجراء التعرض للجسيمات عن طريق تسخين وسط النمو الكامل ، 0.25٪ التربسين ، و PBS في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ، لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء الاستزراع. بعد غسل 264.7 خلية خام ، أضف ملليلتر واحد من محلول التربسين الدافئ إلى الطبق وقم بإزاحة الخلايا من قاع وعاء زراعة الأنسجة عن طريق الكشط. ثم اجمع الخلايا وقم بعمل تعليق أحادي الخلية عن طريق سحب العينات المتكرر.

باستخدام التريبان الأزرق ، احسب عدد الخلايا ، ثم استخدم وسطا كاملا دافئا مسبقا لصفيحها بكثافة 8000 لكل سنتيمتر مربع في طبق زراعة أنسجة 100 ملم. ثم استخدم وسيطا كاملا لضبط الحجم إلى 10 ملليلتر للحصول على تركيز نهائي يبلغ 50،000 خلية لكل ملليلتر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة للسماح لها بالارتباط.

في خزانة السلامة الحيوية ، استخدم PBS معقما لتخفيف الجسيمات المفلترة بتركيز 0.5 ملليغرام لكل مليلتر ، للحصول على جرعة معالجة تبلغ 5 ميكروغرام لكل مليلتر ، وبمعدل 5 ملليغرام لكل مليلتر ، للحصول على جرعة معالجة 50 ميكروغرام لكل مليلتر. لمعالجة الخلايا بالجسيمات ، افحص الخلايا المزروعة تحت المجهر بتكبير 10x لنمو الخلايا ومورفولوجيا الخلايا وحالة الثقافة والتلوث. يجب أن تكون الخلايا ملتقية بنسبة 30٪ على الأقل في هذه المرحلة.

باستخدام ماصة معقمة، قم بشفط الوسط بشكل معقم واستخدم ملليلترين من 37 درجة مئوية PBS لغسل وعاء الاستزراع مرتين. أضف جرعة محددة مسبقا من الجسيمات ذات الوسط الطازج واحتضان المزارع عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لموازاة التعرض المستخدم في التحليل المتزامن للسمية الجينية والسامية اللاجينية لإيقاف الخلايا في الطور ، بعد غسل الخلايا ، أضف ملليلترين من الوسط الدافئ مسبقا مع خمسة ميكرولتر لكل مليلتر من محلول كولسيميد إلى الثقافة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعتين.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسيط تماما واستخدم PBS الدافئ لغسل الخلايا مرتين. ثم أضف محلول التربسين واحتضان المزارع عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. باستخدام مكشطة الخلايا ، افصل الخلايا وأضف 10 ملليلتر من PBS لتعطيل التربسين.

ثم قم بعمل ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل عشر مرات على الأقل لإنشاء معلق أحادي الخلية ، ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملليلترا. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي متأرجح للخارج ، وقم بتدوير تعليق الخلية عند 400 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. لإجراء علاج ناقص التوتر ، قم بإزالة المادة الطافية من الأنابيب دون إزعاج حبيبات الخلية ، واترك ما يقرب من 0.5 مل من PBS.

اكسر حبيبات الخلية برفق واستخدم ماصة P200 لعمل تعليق خلية واحدة. ثم أضف أربعة ملليلتر من محلول كلوريد البوتاسيوم المسخن مسبقا ، وقم بإسقاطه مع رج لطيف. احتضان معلق الخلية في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد العلاج ناقص التوتر ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة حجم متساو من المثبت إلى الأنبوب ، وتخلط برفق عن طريق قلب الأنبوب. الطرد المركزي الأنابيب عند 400 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. في هذه المرحلة ، سيزداد حجم حبيبات الخلية وتصبح بيضاء اللون وأكثر وضوحا.

قم بإزالة المادة الطافية. أضف أربعة ملليلتر من المثبت الطازج ، واحتضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب ، وقم بإزالة المادة الطافية ، واستخدم أربعة ملليلتر من المثبت لغسل الخلايا مرتين أخريين.

اغمر الشرائح الزجاجية بالكامل في منظف سائل بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة. ثم اشطف الشرائح جيدا بماء الصنبور البارد الجاري لمدة 30 دقيقة. استخدم الماء المقطر لشطف الشرائح ثلاث مرات لإزالة المنظف تماما.

ثم اغمرها في الماء المقطر ، وقم بتخزين الشرائح في الثلاجة طوال الليل. قم بإسقاط عشرة ميكرولترات من تعليق الخلية على شريحة مبللة مبردة ، واتركها تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. لتلطيخ العينات وتركيبها ، قم بإعداد 50 مل من محلول تلطيخ giemsa عن طريق خلط جزء واحد من محلول صبغة giemsa ، مع جزء واحد من PBS ، وصبها في وعاء كوبلين.

اغمر الشرائح في محلول تلطيخ لمدة 20 دقيقة ، ثم اشطف الشرائح بالماء المقطر لإزالة البقع الزائدة ، واستخدم مجفف الشعر على الفور لتجفيف الشرائح. اترك الشرائح في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، ضع قطرة واحدة من وسط التثبيت على الشريحة.

ضع زلة غطاء برفق في الأعلى ، واترك وسيط التثبيت ينتشر ببطء فوق الشريحة. ثم استخدم منشفة ورقية لإزالة الوسط الزائد. أخيرا ، استخدم مجهر المجال الساطع بتكبير 100x لفحص الانحرافات الكروموسومية الهيكلية في انتشار الطور الطوري.

توضح هذه الصورة أن انتشار الطور الطوري الطبيعي للفأر ، سيحتوي على 40 كروموسوما غير مركزي. يؤدي العلاج بالجسيمات إلى حدوث انحرافات كروموسومية مختلفة ، مثل كسر الكروماتيد ، وجزء لامركزي ، وكروموسوم حلقي ، وكروموسوم ثنائي المركز ، ودقائق مزدوجة ، ونقل روبرتسونيان ، والتكرار. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب استخدام الخلايا المتكاثرة فقط.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل M-FISH و SKY ، للإجابة على أسئلة إضافية. مثل ما إذا كانت الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات موجودة. لا تنس التحذيرات والمواد المسرطنة ، والاحتياطات التي يجب اتخاذها دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.