الببتيد المستمدة من طريقة لنقل الجينات والبروتينات عبر الخلوي والحواجز Organellar في النباتات

الهدف العام من هذه الطريقة المستمدة من الببتيدات هو نقل الجينات والبروتينات عبر الحواجز الخلوية والعضية في النباتات. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية من خلال تعديل النباتات عبر استخدام مترافقات ببتيدية مصممة عقلانياً تعمل على توصيل جينات وبروتينات متنوعة للتوسط في التعبير عن جينات محددة. وتتمثل الميزة المباشرة لهذه التقنية في أنها تعتمد إجراءً بسيطاً للنقل الجيني بمساعدة الحقنة في أوراق النباتات، وذلك باستخدام ببتيدات يمكنها تجاوز الحدود الخلوية والعضية.

لقد طورنا طريقة تحويل نباتية بسيطة وفعالة ومبتكرة لأن الطرق التقليدية مكلفة، وغير قابلة للتطبيق على بعض أنواع النباتات، وغير قادرة على استهداف العضيات داخل الخلايا. ستقوم جو-آن تشيرش بشرح الإجراء مع يوكو هورii، الفنية في مختبري. قم بتحضير تركيبة الحمض النووي DNA البلازمي الببتيدية كما هو موضح في البروتوكول النصي.

عند إضافة الببتيد إلى الحمض النووي للبلازما، سيتكون محلول عكر. ويصبح الخليط رائقاً عند التخفيف بالماء عالي النقاء وصولاً إلى الحجم النهائي المحدد في البروتوكول النصي. انقُل 800 µL من المحلول المخفف إلى خلية قياس (cuvette) لإجراء تحليل تشتت الضوء الديناميكي.

قم بتحديد القطر الهيدروديناميكي ومؤشر تعدد التشتت للمعقدات المتكونة باستخدام جهاز zetananosizer. استخدم ليزر الهيليوم-نيون بطول موجي 633 nanometer عند درجة حرارة 25 °C وبزاوية كشف تشتت خلفي تبلغ 173 درجة. بعد قياسات الحجم، انقل المحلول إلى خلية شعيرية مطوية لقياس جهد زيتا وفقاً للمعاملات الافتراضية لثابت العزل الكهربائي، ومعامل الانكسار، ولزوجة الماء عند 25 °C.

لملاحظة المحلول المعقد باستخدام مجهر القوة الذرية، يتم ترسيب 10 µL على السطح المكسور حديثاً لصفيحة الميكا، وتترك الميكا لتجف في الهواء طوال الليل في طبق بتري بلاستيكي مغطى. يتم الحصول على صورة للمعقدات في الهواء عند 25 °C باستخدام عتلة سيليكونية ذات ثابت نابض يبلغ 1.3 N/m في وضع النقر (tapping mode). يتم استخدام نباتات Arabidopsis thaliana بعمر ثلاثة أسابيع، نمت تحت دورة إضاءة مدتها 16 ساعة من الضوء و8 ساعات من الظلام، عند درجة حرارة 22 °C.

اختر ثلاث أوراق على الأقل لإجراء عملية عفن transfection لتكون بمثابة ثلاث مكررات لقياس كمية التعبير الجيني. املأ حقنة بلاستيكية بدون إبرة سعة 1 مل بـ 100 µL من المحلول المعقد لعملية transfection لورقة واحدة. بعد ذلك، ضع طرف الحقنة على السطح السفلي (الظهري) للورقة.

اضغط بطرف المحقنة قليلاً على الورقة، ثم ادفع مكبس المحقنة ببطء مع تسليط ضغط مضاد باستخدام إصبع السبابة ليد ترتدي قفازاً من اللاتكس من الجانب المقابل. يمكن ملاحظة نجاح عملية الترشيح من خلال انتشار منطقة مشبعة بالماء في الورقة. قم بتمييز الأوراق التي تم ترشيحها لسهولة التعرف عليها.

تُحضن النبتة المنقول إليها الحمض النووي البلازميدي الببتيدي لمدة 12 ساعة في غرفة نمو. ولتقييم كفاءة النقل، يتم أولاً استئصال الورقة المنقول إليها بالكامل. أما في تجارب النقل التي تستخدم ناقل رينيلّا لوسيفيراز (Renilla Luciferase) المراسِل، فيتم تحديد كفاءة النقل كمياً باستخدام طقم مقايسة رينيلّا لوسيفيراز (Renilla Luciferase assay kit).

أولاً، ضع كل ورقة مستأصلة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 millileter. أضف 100 microliters من 1X Lysis Buffer لكل أنبوب. وبنفس الطريقة، قم بتحضير مستخلصات من أوراق التحكم غير المنقولة في ثلاث مكررات.

اطحن الورقة باستخدام مدقة تجانس، ثم حضّن المستخلص الناتج عند 25 °C لمدة تتراوح من 6 إلى 10 ساعات. بعد الحضن، قم بطرد المستخلص مركزياً بسرعة 12,470 ×g في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة دقيقة واحدة. انقل 20 µL من المستخلص الرائق إلى عين في صفيحة ميكروية ذات 96 عيناً.

استخدم الحجم المتبقي لتقدير تركيز البروتين الكلي باستخدام طقم تحليل البروتين BCA وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك، أضف 100 µL من ركيزة تحليل Renilla Luciferase بتركيز 1x إلى البئر واخلط عن طريق السحب والضخ البطيء بالماصة. ضع اللوحة الدقيقة في قارئ ألواح دقيقة متعدد الأوضاع وابدأ عملية القياس.

بالنسبة لتجارب عفن الخلايا باستخدام ناقل مراسل للبروتين الفلوري الأخضر، راقب الفلورة باستخدام مجهر مسح ليزري بؤري. أولاً، قص حواف ورقة كاملة للمساعدة في إزالة الفراغات الهوائية. ثم، قم بإزالة المكبس من محقنة سعة 10 milileter وضع كل ورقة مستأصلة أو مقطع ورقي داخل المحقنة.

أعد تركيب المكبس وادفعه برفق إلى قاع المحقنة دون سحق الورقة. اسحب الماء إلى داخل المحقنة حتى تمتلئ تقريباً إلى النصف. وجه المحقنة للأعلى واضغط على المكبس لإزالة الهواء من المحقنة من خلال الطرف.

بعد ذلك، قم بتغطية طرف المحقنة واسحب المكبس لأسفل ببطء لطرد الهواء من الورقة. كرر هذه العملية عدة مرات حتى تبدو الورقة شفافة. بعد ذلك، قم بتغطية سطح شريحة المجهر بشريط لاصق.

استخدم شفرة لقص منطقة مربعة على الشريط اللاصق تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب عينة الورقة، ثم انزع القطعة المربعة من الشريط باستخدام ملقط لإنشاء حجرة للعينة. سيعمل الشريط كفاصل بين الشريحة وغطاء الشريحة. ضع الورقة في الحجرة بحيث يكون السطح الظهري (abaxial) مواجهًا للأعلى، ثم املأ المساحة المتبقية من الحجرة بالماء.

أغلق الورقة داخل الغرفة باستخدام شريحة غطاء زجاجية وثبّت حواف شريحة الغطاء بشريط لاصق. افحص عينة الورقة باستخدام مجهر مسح ليزري بؤري تحت عدسة شيئية 40x أو عدسة شيئية غمر مائي 63x. يمكن تصور فلورة GFP عند طول موجي للإثارة يبلغ 488 nanometers.

يجب أن يتوفر في التحضير الأمثل لتركيبة الحمض النووي (DNA) في بلازما الببتيد، بنسبة ببتيد إلى حمض نووي تبلغ 0.5، متوسط قطر يبلغ حوالي 290 نانومتر ومؤشر تشتت متعدد منخفض يبلغ حوالي 0.3، مما يشير إلى توزيع موحد للحجم. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تظهر المعقدات جهد زيتا يبلغ حوالي 30 ملي فولت. تظهر هنا صورة ممثلة لمعقدات بلازما الببتيد والحمض النووي (DNA) باستخدام مجهر القوة الذرية.

لوحظ تكون معقدات كروية متجانسة. وباستخدام تركيبة الببتيد مع الحمض النووي للبلازما (plasma DNA)، يمكن تحقيق توصيل وتعبير عن الحمض النووي للبلازما مستهدف للنواة في نبات Arabidopsis thaliana، بقيمة تقديرية لإنزيم Renilla Luciferase تبلغ حوالي 100,000 لكل ميليغرام. كما أُجري الفحص المجهري على الأوراق المعالجة بمعقدات مُحضرة باستخدام الحمض النووي للبلازما الذي يشفر البروتين المراسل GFP لتقييم التعبير الجيني.

كشفت الصور أنه في الخلايا التي تم تحويلها باستخدام معقدات DNA البلازمي والببتيد غير المستهدف، لوحظ بوضوح فلورة خضراء منتشرة تتوافق مع تعبير GFP، وتبين أنها تتمركز في العصارة الخلوية. وقد مهدت هذه التقنية بعد تطويرها الطريق للباحثين في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية لإيصال حمولات مختلفة من البروتينات والأحماض النووية إلى النباتات الحية. بعد مشاهدة هذا الفيديو وقراءة البروتوكول النصي، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وتوصيف وتطبيق تركيبات محسنة مختلفة لكل نوع من أنواع الحمولات، والتي تشمل DNA البلازمي، أو DNA أو RNA مزدوج السلسلة، والبروتين.