القيطم البويضات: طرق الأمثل ل microinjection، إزالة طبقات الخلية مسامي، والتغييرات الحل السريع في التجارب الكهربية

الهدف العام من هذا الإجراء هو التعبير عن بروتينات جديدة ، مثل القنوات الأيونية في بويضات Xenopus. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أي مجال يتطلب نظام تعبير وظيفي. تتمثل المزايا الرئيسية لاختلافات هذه التقنية في سرعة البويضات وموثوقيتها وبقائها المحسن.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لعمل القنوات الأيونية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيقه على دراسة أي بروتين آخر. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أن الطرق الكلاسيكية أدت إلى انخفاض معدل بقاء البويضات.

بعد إزالة فصوص المبايض من إناث الضفادع وفقا لبروتوكول النص ، ضع الفصوص في محلول بارث المعدل المعقم المكمل بالبنسلين والستربتومايسين. اقطع الفصوص للسماح بوصول الأنسجة إلى الأكسجين. لتمييز المرحلة الخامسة إلى الست بصيلات ، استخدم الملقط لتثبيت المبيض ثم قم بخفض حلقة بلاتينية فوق البصيلات واسحب الحلقة برفق لتعطيل النسيج الضام مع المسام من أنسجة المبيض.

قم بفرز البويضات ذات المظهر الصحي باستخدام الحلقة البلاتينية. استخدم ماصة باستور بلاستيكية مقطوعة بقطر 1.5 مم لنقل بصيلات مختارة إلى طبق بتري قطره 35 ملم. بعد تحضير الحمض النووي الريبي (cRNA) لمستقبلات GABA A وماصات الحقن الدقيقة وفقا لبروتوكول النص، استخدم زيت البارافين ومحقنة سعة 10 ملليلتر بإبرة رفيعة لردم ماصة الحقن الدقيق.

ثم قم بتركيب الماصة على جهاز حقن دقيق محلي الصنع. باستخدام ماصة ذات طرف بلاستيكي معقم ، ضع قطرة من محلول mRNA على الجانب النظيف من قطعة من اللدائن الحرارية المقاومة للرطوبة. ثم اغمر طرف ماصة الحقن في القطرة وقم بتشغيل المحرك لسحب المكبس.

يجب أن يدخل محلول mRNA إلى الماصة ويشكل واجهة مرئية مع الزيت. بعد ذلك، اسحب طرف الماصة من القطرة، واضغط إيجابيا على داخل ماصة الحقن. يجب أن تتشكل قطرة من محلول mRNA عند طرف ماصة الحقن.

باستخدام طبق بتري مقاس 60 ملم مع شبكة من النايلون ملتصقة بالجزء السفلي ومغطى ب MBS للحقن ، قم بمحاذاة البصيلات مع أقمدة نباتية تشير إلى الأعلى. باستخدام المعالج الدقيق، ضع ماصة الحقن فوق بصيلات فردية. أدخل إبرة الحقن في وسط العمود الخضري واضغط إيجابيا على داخل الماصة لحقن 50 نانولتر من الرنا المرسال بمعدل تدفق يبلغ 0.6 ميكرولتر في الدقيقة.

انتظر من خمس إلى 10 ثوان قبل إزالة طرف ماصة الحقن من الجريب لتجنب هروب الحمض النووي الريبي المرسال. انقل البصيلات المحقونة إلى طبق بتري جديد مليء بملليلترين من MBS. ضع الطبق في مبرد نبيذ على حرارة 18 درجة مئوية.

احتضان البصيلات المحقونة لمدة يوم إلى سبعة أيام قبل التسجيل ، اعتمادا على هوية البروتين المعبر عنه حديثا. لتجريد البصيلات ، انقل عشر بصيلات محقونة إلى أنبوب زجاجي من البورسليكات يحتوي على 0.5 ملليلتر من MBS ، ومليغرام واحد لكل مليلتر من الكولاجيناز ، و 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من مثبط التربسين. اغمر الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 36 درجة مئوية واحتضان البصيلات لمدة 20 دقيقة.

درجة الحرارة هنا حرجة لأن درجة واحدة أكثر قد تقتل البويضات. اشطف البصيلات عن طريق نقلها إلى أنبوب ثان يحتوي على مليلتر واحد من MBS في درجة حرارة الغرفة ، واتركها في الأنبوب لمدة عشر ثوان تقريبا. ثم انقل البصيلات إلى أنبوب ثالث يحتوي على 0.5 مل من MBS مزدوج التركيز يحتوي على أربعة مليضرات EGTA ، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق ، مع هز الأنابيب من حين لآخر.

يعد وقت الحضانة البالغ أربع دقائق أمرا بالغ الأهمية لضمان انفصال طبقات البصيلات عن البويضة. اشطف البصيلات عن طريق نقلها إلى أنبوب آخر يحتوي على مليلتر واحد من MBS في درجة حرارة الغرفة ، واتركها في الأنبوب لمدة 10 ثوان تقريبا. انقل البويضات إلى طبق بتري 35 ملم يحتوي على ملليلترين من MBS.

بعد ذلك ، تحت مجهر ستيريو ، استخدم حلقة بلاتينية لفصل الأظرف الخارجية عن البصيلات ببساطة عن طريق دفع البويضة العارية بعيدا. قم بتخزين البويضات المجردة حتى الاستخدام. في هذه التجربة ، تم حقن بويضات Xenopus المفردة ميكانيكيا بطلاء mRNA للوحدات الفرعية لمستقبلات GABA A.

ثم تمت إزالة طبقات الخلايا المسامية. تم تثبيت البويضات بالجهد عند سالب 80 مللي فولت وتعرضت لتركيزات متزايدة من GABA ووجود THDOC ، وهو معدل خيفي إيجابي قوي لمستقبل GABA A. تظهر هذه اللوحة السعات الحالية المستمدة اعتمادا على تركيزات GABA ، مما يشير إلى حساسية هذه المجموعة الفرعية للوحدة تجاه GABA.

المعادلة المستخدمة هي I (c) Imax / n) حيث c هو تركيز GABA ، EC50 هو تركيز GABA في وجود THDOC ميكرومولار واحد ، مما ينتج عنه سعة تيار نصف الحد الأقصى. Imax هو السعة القصوى للتيار. I هو السعة الحالية ، و n هو معامل التل.

بلغ EC50 لمستقبلات ألفا فور بيتا اثنين دلتا GABA A 0.41 0.12 ميكرومولار و n كان 0.76 0.04 بمجرد إتقانها ، يمكن إزالة طبقات الخلايا الجريبية في نصف ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لتحسين إجراء التعبير عن البروتين في بويضات Xenopus. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل بويضات Xenopus المحاطة بطبقات الخلايا المسامية ، والحقن الدقيق باستخدام mRNA والإزالة اللاحقة لطبقات الخلايا المسامية.