بروتين طريقة التحضير لتحديد إنتاجية عالية من البروتينات التفاعل مع العامل المساعد النووية عن طريق LC-MS / MS تحليل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد البروتينات التي تتفاعل مع العامل المساعد النووي باستخدام تحليل LC-MS / MS. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بآليات النسخ في مجال تنظيم الجينات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تحديد البروتينات التي تتفاعل مع عامل مساعد نووي.

علاوة على ذلك ، تتيح لنا هذه الطريقة فهم الآليات التنظيمية النسخية للعوامل النووية المستهدفة بشكل أفضل. حصاد HEK 293 خلية تعبر عن ARIP4 الموسومة بالعلم بعد 36 ساعة من النقل عن طريق غسل ورقة الخلية باستخدام PBS المثلج البارد وجمع الخلايا باستخدام مكشطة الخلية. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر ثم جهاز طرد مركزي على حرارة 8000 جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.

قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية بخمسة أضعاف حجم الحبيبات من عازلة الملح العالي. قم بتدوير الخليط لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد 20 دقيقة من الدوران ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 17 ، 700 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، انقل المواد الطافية إلى أنبوب جديد سعة ملليلترين وأضف المخزن المؤقت للتخفيف إلى ثلاثة أضعاف حجم المادة الطافية. قم بإجراء طرد آخر ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة ملليلتر. خلال عملية الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، اغسل 50 ميكرولترا من الخرز المضاد للعلم باستخدام PBS.

ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 2000 جرام لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وكرر خطوات الغسيل أولا باستخدام 1 مولي جلايسين هيدروكلوريد ثم باستخدام هيدروكلوريد تريس مولار. ثم يغسل مرتين باستخدام محلول ملح منخفض.

بعد ذلك ، امزج 50 ميكرولترا من الخرز المغسول مع مستخلصات الخلايا الكاملة. قم بتدوير الخليط برفق لمدة أربع ساعات عند درجتين إلى أربع درجات مئوية. ثم استخدم طرفا ضعيفا لنقل العينة إلى عمود دوران دقيق والسماح للمحلول بالتنقيط في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

بتجميد التدفق في النيتروجين السائل وتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، اغسل حبات العلم بمحلول ملح منخفض خمس مرات. للعزف ، ضع العمود في أنبوب سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي على حرارة 2000 جرام لمدة دقيقة واحدة لتجفيف الخرز.

قم بتغطية الجزء السفلي من العمود ثم أضف 50 ميكرولترا من 1 مولي جلايسين هيدروكلوريد. رجي الخليط برفق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق ، ضع العمود في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 2000 جرام لمدة دقيقة واحدة.

قم بتحييد المحلول الملوطف ب 10 ميكرولتر من هيدروكلوريد تريس مولي واحد واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات والدوامة. أضف 50 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 100 ملليمول. 10 ميكرولتر من الأسيتونيتريل ، ميكرولترين من الديثيوثريتول و 50 ميكرولتر من العينة المعادلة.

احتضن لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية. بعد الحضانة ، اترك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم أضف 10 ميكرولترات من 333 مللي مولار يودوأسيتاميد إلى العينة واحتضن في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، أضف 10 ميكرولترات من التربسين إلى الخليط واحتضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

اليوم التالي ، انقل المنتج النهائي إلى منشأة LC-MS / MS أو إلى مختبر قياس الطيف الكتلي التابع لجهة خارجية لتحليله. تظهر هذه الصورة تلطيخا فضيا لحاتمة العلم الموسومة بعلامة ARIP4 معبرا عنها في خلايا HEK 293 بعد الترسيب المناعي بجسم مضاد خاص بالعلم والفصل عن طريق الرحلان الكهربائي. كعنصر تحكم ، تم إجراء تنقية وهمية على خلايا HEK 293 التي لم تعبر عن البروتينات الخارجية.

باستخدام طريقتنا ، من الممكن تحديد العوامل المساعدة النووية المفترضة من خلال عامل النسخ الذي يثير اهتمامها وتعزيز فهمنا لآليات تنظيم النسخ.