المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تنفيذ المجهر التصويري لمدى الحياة الفلورية ذو البوابة الزمنية، أو FLIM، في سير عمل مؤتمت للأطباق متعددة الآبار باستخدام برمجيات مفتوحة المصدر وأجهزة أساسية. ويمكن تطبيق هذه المنهجية على قراءات تعتمد على FLIM في سلسلة من الخلايا المثبتة أو الحية. وهي مفيدة بشكل خاص لقراءة معالجة الإشارات الخلوية أو التفاعلات البروتينية.

تكمن المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن قياس عمر الفلورة (FLIM) يوفر قراءات كمية قوية، ويمكنه تحديد كسر مجموعة التفاعل في قياس واحد. ويتيح لنا تطبيق تقنيات التحليل الشامل على آلاف الخلايا عبر مئات من مجالات الرؤية الاستفادة من قراءات نقل طاقة فورستر الرنيني (FRET)، والاستفادة، على سبيل المثال، من تغيرات عمر الفلورة التي تصل إلى حوالي 20 picoseconds.

سيقوم شونيل كومار، مساعد الأبحاث لدينا، وإيان مونرو، مطور البرمجيات لدينا، بتوضيح الإجراء باستخدام Frederik Gorlitz. ابدأ بتشغيل برنامج micromanager وافتح إضافة openFLIM-HCA. ومن علامة تبويب تحكم FLIM، اختر ملف معايرة صندوق التأخير (delay box calibration file)، ثم افتح ملفات المعايرة.

اختر ملف المعايرة الخاص بالمزيج المحدد من وحدة مولد التأخير ومعدل تكرار الليزر المطلوب. من قائمة الملف (file menu)، اختر "set base folder" ثم حدد المجلد الذي سيتم حفظ البيانات فيه. بعد التأكد من ضبط جميع المعلمات المناسبة، اضبط يدويًا عرض البوابة على أربعة نانوثانية في صندوق تحكم مكثف الضوء ذي البوابة (gated optical intensifier control box) للتجربة بأكملها.

للحصول على بيانات صورة دالة استجابة الجهاز، ضع حاجب الحزمة يدوياً في كاسيت مكعب المرشح قبل الشيئية لمنع تسرب أي ضوء ليزر، وقم بإمالة حاجب الحزمة لتقليل أي انعكاس إلى إطار المجهر. في علامة تبويب التحكم في مسار الضوء، اضبط مرشحات الإثارة، والمرشح ثنائي اللون، ومرشحات الانبعاث في وحدة القرص الدوار، بحيث يمكن تصوير جزء من ضوء الإثارة المشتت من قرص Nipkow الدوار دون إشباع النظام لمدة زمنية لا تقل عن 200 milliseconds من زمن تكامل الكاميرا. في علامة تبويب التحكم في FLIM، استخدم وظيفة البحث عن النقطة القصوى عبر النطاق الكامل للتأخيرات التي يغطيها صندوق التأخير السريع القابل للبرمجة.

ثم تحقق من مخطط المخرجات المعروض. وقم بضبط أوقات تأخير المسار، بحيث يقع ملف دالة الاستجابة الكاملة للجهاز ضمن نطاق مسح صندوق التأخير السريع. قم بضبط معلمات الكثافة المحايدة ووقت التعرض.

بالإضافة إلى تراكم الإطارات، بحيث لا تتشبع الكاميرا في بوابة زمن السطوع ولا يقل وقت التكامل الفعال عن 200 milliseconds. من قائمة تحكم FLIM، اختر مربع التأخير السريع (fast delay box) واضبط خطوات تأخير قدرها 25 picoseconds عبر نطاق التأخير الكامل. بعد ذلك، اختر تعبئة التأخيرات (populate delays) وانقر على التقاط صورة FLIM (snap FLIM image) للحصول على صورة دالة استجابة الجهاز.

وانتظر حتى تكتمل عملية الاستحواذ. من قائمة التحكم في مسار الضوء، اختر الكثافة المتعادلة وانقر على "blocked" لحجب الليزر. افتح قائمة التحكم في FLIM واختر صندوق التأخير السريع لتقليل عدد خطوات التأخير عن طريق زيادة القيمة في صندوق الزيادة.

ثم انقر فوق التقاط صورة FLIM للحصول على صورة خلفية للكاميرا. وللحصول على بيانات صبغ المرجع، انتقل إلى علامة تبويب التحكم XYZ وأدخل البئر H4 في مربع حوار الانتقال إلى البئر. بعد ذلك، انتقل إلى علامة تبويب التحكم في مسار الضوء وحدد مرشحات الإثارة والمرشح ثنائي اللون ومرشحات الانبعاث المناسبة لتصوير البروتين الفلوري M turquoise باستخدام وظيفة إيجاد النقطة القصوى عبر النطاق الكامل لمربع التأخير السريع.

ثم قم بضبط المعلمات المناسبة للحصول على بيانات الصبغة المرجعية وصورة خلفية مقابلة لها كما تم توضيحه للتو. وللحصول على بيانات FLIM من عينة في لوحة متعددة الآبار، انتقل إلى قائمة إعداد الاستحواذ المتسلسل HCA. اختر علامة تبويب مواقع XYZ وحدد الآبار التي يجب تصويرها وعدد مجالات الرؤية التي سيتم الحصول عليها لكل بئر.

اختر مجال رؤية ممثلاً يحتوي على العينة المراد تصويرها، واضبط مرشح الكثافة المحايدة الأمثل في وقت التكامل للكاميرا للوصول إلى 75% من النطاق الديناميكي لكاميرا القراءة. في علامة تبويب التحكم XYZ، اختر التحكم في إرجاع التركيز في مربع حوار التركيز التلقائي، وقم بتركيز المجهر يدوياً على الخلايا أو التراكيب المستهدفة. اضبط نطاق بحث التركيز التلقائي على 2000 micrometers ثم اضغط enter.

ثم انقر فوق AF now لبدء إجراء التركيز التلقائي. ستظهر قيمة الإزاحة في حقل focus offset auto focus. أدخل قيمة الإزاحة هذه في نافذة AF offset، وانقر فوق AF now مرتين لتكرار إجراء التركيز التلقائي.

يجب أن تكون قيم الإزاحة الآن مضبوطة على صفر، مما يشير إلى عمل نظام التركيز التلقائي بشكل صحيح. بعد ذلك، من علامة تبويب التحكم في FLIM، اختر وظيفة البوابات التلقائية (autogating) لضمان أخذ عينات لوغاريتمية لنقاط التأخير. اضبط عدد الإطارات التراكمية على قيمة تحقق وقت الحصول على البيانات الإجمالي المطلوب.

بعد ذلك، في مربع حوار استحواذ الـ FLIM، انقر فوق زر بدء تسلسل HCA لتشغيل عملية استحواذ FLIM للطبق متعدد الآبار والحصول على صورة خلفية للكاميرا كما تم توضيحه للتو. يظهر هنا اختبار fret بنظام FLIM نموذجي باستخدام نظام fret نموذجي يتم التعبير عنه في خلايا مشتركة (cocells) وطبق متعدد الآبار، مع أمثلة لصور عمر الفلورة التي تم استحواذها تلقائياً لمجالات رؤية نموذجية تظهر في كل بئر. في هذه التجربة، أظهرت آبار الضابط السلبي أطول أعمار فلورة، بينما أظهرت أعمار المانح أقل قيم لـ fret في تركيبات fret ذات أطوال الوصلات الأقصر.

بشكل عام، تباين متوسط العمر الزمني المحتسب لجميع حقول الرؤية في كل بئر عبر الأطباق متعددة الآبار. ويوضح حساب متوسط ملف اضمحلال شدة الفلورية للمانح لجميع الخلايا المصورة في البئر A1، جنباً إلى جنب مع الملاءمة لنموذج الاضمحلال أحادي الأس و دالة استجابة الجهاز، أن نموذج الملاءمة صالح. كما يظهر تحليل إضافي لمتوسط العمر الزمني للفلورية لكل عمود في الطبق متعدد الآبار، والذي تم الحصول عليه من ملاءمة أحادية الأس على مستوى البكسل، أن العمر الزمني يتناقص في تركيبات FRET ذات أطوال الرابط الأقصر، مما يحاكي تجربة ذات كفاءات FRET مختلفة.

في هذه التجربة، تم تطبيقه نموذج اضمحلال أسي واحد على بيانات FLIM الخاصة بمقايسة fret لدراسة تأثير مثبطات مختلفة على بلمرة البروتين. توضح خريطة لوحة عمر الفلورة متوسط العمر لكل بئر، وهو متوسط ثمانية حقول رؤية. مجموعة صغيرة واحدة، يتم فيها تصوير أربعة حقول رؤية لكل بئر، بينما يمكن إكمال مقايسة FLIM الخاصة بنا في غضون ساعتين ونصف تقريبًا، بما في ذلك الوقت اللاbil لتحصيل دالة استجابة الجهاز، وبيانات الصبغة المرجعية، وإجراء التحليل في برنامج FLIM fit.

عند إجراء مقايسة FLIM، من المهم تذكر الحصول على دالة استجابة الجهاز وبيانات الصبغة المرجعية جنباً إلى جنب مع صور الخلفية الخاصة بهما، بحيث تتوفر لديك جميع المعلومات اللازمة لتحليل بيانات FLIM. وباستخدام برنامجنا مفتوح المصدر، FLIM fit، يمكن أيضاً ملاءمة هذه البيانات في نماذج اضمحلال أكثر تعقيداً؛ وهو ما يسمح، على سبيل المثال، بتحديد كسر مجموعة fret.

تساعد تقنية FLIM HCA الخاصة بنا الباحثين في مجتمع اكتشاف الأدوية على إجراء قياسات دقيقة لـ fret. ونأمل في المستقبل أن تمكن هذه التقنية من قياس ثوابت التفكك في المقايسات القائمة على الخلايا. كما نأمل أن يساهم هذا الفيديو البحثي والمعلومات الواردة في الـ Wiki الخاصة بنا في مساعدة الباحثين الآخرين على بناء أجهزتهم الخاصة بتقنية FLIM HCA وتطبيقها على fret والمقايسات الأخرى.

لا تنسَ أن العمل باستخدام الليزر قد يكون خطيرًا، وأنه يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل إحاطة جميع أشعة الليزر، عند استخدام هذه الأجهزة.