المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري
يناير 18, 2017
نقدم ارتفاع محتواها أداة مفتوحة المصدر تحليل (HCA) باستخدام آلية التصوير مضان عمر (FLIM) لمعايرة تفاعلات البروتين باستخدام فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) قراءات مقرها. يتم التحكم والحصول على البيانات لهذا الصك openFLIM-HCA من قبل البرامج المكتوبة في μManager وإجراء تحليل البيانات في FLIMfit.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تنفيذ الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة ذات البوابات الزمنية ، أو FLIM ، في تدفق عمل آلي متعدد الآبار باستخدام برامج مفتوحة المصدر وأجهزة أساسية. يمكن تطبيق هذه المنهجية على القراءات المستندة إلى FLIM في سلسلة من الخلايا الثابتة أو الحية. وهو مفيد بشكل خاص لقراءة معالجة إشارة الخلية أو تفاعلات البروتين.
تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن FLIM توفر قراءات كمية قوية ويمكن أن توفر جزءا تفاعليا للسكان في قياس واحد. يتيح لنا تطبيق تقنيات التحليل العالمية على آلاف الخلايا عبر مئات مجالات الرؤية استخدام نقل طاقة الراتنج المعزز ، أو قراءات FRET. والاستفادة ، على سبيل المثال ، من التغييرات في العمر الافتراضي إلى حوالي 20 بيكو ثانية.
سيظهر الإجراء مع فريدريك جورليتز سونيل كومار ، باحثنا المشارك وإيان مونرو ، مطور البرامج لدينا. ابدأ ببدء تشغيل المدير الصغير وافتح المكون الإضافي openFLIM-HCA. ضمن علامة التبويب التحكم في FLIM، حدد ملف معايرة مربع التأخير، وافتح ملفات المعايرة.
حدد ملف المعايرة للمجموعة المحددة من وحدة مولد التأخير ومعدل التكرار بالليزر. ضمن قائمة الملف، حدد تعيين المجلد الأساسي وحدد المجلد الذي سيتم حفظ البيانات فيه. بعد التأكد من تعيين جميع المعلمات المناسبة ، قم بتعيين عرض بوابة يدويا بمقدار أربعة نانو ثانية في صندوق التحكم في المكثف البصري المسور للتجربة بأكملها.
للحصول على بيانات صورة وظيفة استجابة الجهاز ، ضع كتلة شعاع يدويا في كاسيت مكعب المرشح قبل الهدف لمنع هروب أي ضوء ليزر وزاوية كتلة الشعاع لتقليل أي انعكاس مرة أخرى في إطار المجهر. ضمن علامة تبويب التحكم في مسار الضوء ، اضبط مرشحات الإثارة وثنائية اللون والانبعاث في وحدة القرص الدوار ، بحيث يمكن تصوير جزء ضوء الإثارة المنتشر من قرص Nipkow الدوار دون تشبع النظام لمدة لا تقل عن 200 مللي ثانية من وقت تكامل الكاميرا. ضمن علامة التبويب التحكم في FLIM، أستخدم وظيفة البحث عن الحد الأقصى للنقطة على النطاق الكامل للتأخيرات التي يغطيها مربع التأخير السريع القابل للبرمجة.
ثم تحقق من تتبع الإخراج المعروض. وقم بتعيين أوقات تأخير الدورة ، بحيث يكون ملف تعريف وظيفة استجابة الجهاز الكامل ، ضمن نطاق المسح الضوئي لصندوق التأخير السريع. اضبط معلمات الكثافة المحايدة ووقت التعرض.
بالإضافة إلى تراكم الإطار ، بحيث لا تكون الكاميرا مشبعة في بوابة وقت السطوع ولا يقل وقت التكامل الفعال عن 200 مللي ثانية. ضمن قائمة التحكم في FLIM ، حدد مربع التأخير السريع واضبط خطوات تأخير 25 بيكو ثانية على نطاق التأخير الكامل. بعد ذلك ، حدد ملء التأخيرات وانقر فوق snap flim image للحصول على صورة وظيفة استجابة الأداة.
وانتظر حتى يكتمل الاستحواذ. ضمن قائمة التحكم في مسار الضوء، حدد كثافة محايدة وانقر فوق محظور لحجب الليزر. افتح قائمة التحكم في FLIM وحدد مربع التأخير السريع لتقليل عدد خطوات التأخير عن طريق زيادة القيمة في مربع الزيادة.
ثم انقر فوق التقاط صورة FLIM للحصول على صورة كاميرا خلفية. للحصول على بيانات القالب المرجعي ، انتقل إلى علامة التبويب تحكم XYZ وأدخل H4 جيدا في مربع الحوار الانتقال إلى البئر. بعد ذلك ، انتقل إلى علامة التبويب التحكم في مسار الضوء وحدد مرشحات الإثارة وثنائية اللون والانبعاث المناسبة لتصوير بروتين الفلورسنت الفيروزي M باستخدام وظيفة البحث عن النقطة القصوى على النطاق الكامل لصندوق التأخير السريع.
ثم قم بتعيين المعلمات المناسبة للحصول على بيانات القالب المرجعي وصورة الخلفية المقابلة كما هو موضح للتو. للحصول على بيانات FLIM من عينة لوحة متعددة الآبار ، انتقل إلى قائمة اكتساب HCA المتسلسلة للإعداد. حدد علامة التبويب مواضع XYZ وقم بتعيين الآبار التي يجب تصويرها وعدد مجالات الرؤية التي سيتم الحصول عليها لكل بئر.
حدد مجال رؤية تمثيليا يحتوي على العينة المراد تصويرها واضبط مرشح الكثافة المحايدة الأمثل في وقت تكامل الكاميرا للوصول إلى 75٪ من النطاق الديناميكي لكاميرا القراءة. ضمن علامة التبويب تحكم XYZ، حدد التحكم في التركيز البؤري مرة أخرى في مربع حوار التركيز البؤري التلقائي وقم بتركيز المجهر يدويا على الخلايا أو الهياكل ذات الاهتمام. اضبط نطاق البحث عن التركيز التلقائي على 2000 ميكرومتر واضغط على Enter.
ثم انقر فوق التركيز البؤري التلقائي الآن لبدء إجراء التركيز البؤري التلقائي. ستظهر قيمة إزاحة في حقل التركيز البؤري التلقائي لإزاحة التركيز. أدخل قيمة الإزاحة هذه في نافذة إزاحة التركيز البؤري التلقائي، وانقر فوق التركيز البؤري التلقائي الآن مرتين لتكرار إجراء التركيز البؤري التلقائي.
يجب الآن ضبط قيم الإزاحة على الصفر ، مما يشير إلى الأداء الصحيح لنظام التركيز البؤري التلقائي. بعد ذلك ، ضمن علامة التبويب التحكم FLIM ، حدد وظيفة autogating لضمان أخذ عينات لوغاريتمية لنقاط التأخير. قم بتعيين إطارات التجميع إلى قيمة تنتج إجمالي وقت الحصول على البيانات المطلوب.
ثم ، في مربع حوار اكتساب FLIM ، انقر فوق الزر "بدء تسلسل HCA" لتشغيل الحصول على لوحة FLIM متعددة الآبار والحصول على صورة كاميرا خلفية كما هو موضح للتو. هنا يتم عرض مقايسة FLIM التمثيلية باستخدام نظام الحنق النموذجي المعبر عنه في الخلايا المشتركة ولوحة متعددة الآبار ، مع أمثلة على صور عمر التألق المكتسبة تلقائيا لمجالات الرؤية النموذجية الواضحة في كل بئر. في هذه التجربة ، قدمت آبار التحكم السلبية أطول عمر ، وأظهرت أعمار المتبرع أقل تركيبات الحنق بأقصر أطوال الرابط.
بشكل عام ، اختلف متوسط العمر الافتراضي في جميع مجالات الرؤية في كل بئر عبر ألواح الآبار المتعددة. يوضح متوسط ملف تعريف اضمحلال شدة التألق للمتبرع على جميع الخلايا المصورة في البئر A1 جنبا إلى جنب مع الملاءمة لنموذج الاضمحلال الأسي الأحادي ووظيفة استجابة الأداة ، أن نموذج التركيب صالح. يوضح التحليل الإضافي لمتوسط عمر التألق لكل عمود من لوحة الآبار المتعددة ، التي تم الحصول عليها من ملاءمة أسية أحادية البكسل ، انخفاض العمر الافتراضي في تركيبات الحنق بأطوال رابط أقصر ، مما يحاكي تجربة بكفاءات مختلفة من الحنق.
في هذه التجربة ، تم تزويد بيانات FLIM لمقايسة الحنق لعمل مثبطات مختلفة على قلة البروتين بنموذج اضمحلال أسي واحد. توضح خريطة لوحة عمر التألق متوسط العمر لكل بئر في المتوسط عبر ثمانية مجالات رؤية. مجموعة صغيرة واحدة ، تصور أربعة مجالات من المشاهدات لكل بئر ، بينما يمكن إكمال اختبار FLIM الخاص بنا في حوالي ساعتين ونصف ، بما في ذلك الوقت اللازم للحصول على وظيفة استجابة الأداة ، وبيانات القالب المرجعي وإجراء التحليل في FLIM fit.
عند إجراء اختبار FLIM ، من المهم أن تتذكر الحصول على وظيفة استجابة الأداة وبيانات القالب المرجعية جنبا إلى جنب مع صور الخلفية الخاصة بهم حتى تحصل على جميع المعلومات اللازمة لتحليل بيانات FLIM. باستخدام برنامجنا مفتوح المصدر ، FLIM fit ، من الممكن أيضا ملاءمة هذه البيانات في نماذج اضمحلال أكثر تعقيدا. على سبيل المثال ، السماح بتحديد جزء مجموعة الحنق.
تساعدتقنية FLIM HCA الخاصة بنا الباحثين في مجتمع اكتشاف الأدوية على إجراء قياسات قوية للحنك. نأمل في المستقبل أن تمكن هذه التقنية من قياس ثوابت التفكك في المقايسات القائمة على الخلية. نأمل أن تساعد ورقة الفيديو هذه أيضا المعلومات الموجودة في Wiki الباحثين الآخرين في بناء أجهزة FLIM HCA الخاصة بهم وتطبيقها على الحنق والمقايسات الأخرى.
لا تنس أن العمل بالليزر يمكن أن يكون خطيرا وأن الاحتياطات مثل إحاطة جميع أشعة الليزر يجب دائما اتخاذ الاحتياطات عند استخدام مثل هذه الأجهزة.
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة أداة تحليل محتوى عالٍ مفتوحة المصدر (HCA) تستخدم تصوير عمر الفلورة الآلي (FLIM) لفحص تفاعلات البروتينات من خلال قراءات تعتمد على نقل طاقة الرنين فورستر (FRET). تطبق المنهجية على الخلايا الثابتة والحيوية على حد سواء، توفر بيانات كمية قوية حول معالجة إشارات الخلية وتفاعلات البروتين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تصوير ميكروسكوبي لعمر الفلورة (FLIM)
- تفاعلات البروتينات
- تحليل محتوى عالٍ (HCA)
الخلفية
- يسمح FLIM بالقراءات الكمية لتفاعلات البروتينات.
- تُمكّن قراءات FRET من تحليل أجزاء مجموعة التفاعل.
- يمكن أن تقيس التقنية تغيرات العمر حتى 20 بيكو ثانية.
- تعزز مسارات العمل الآلية من كفاءة اكتساب البيانات.
هدف الدراسة
- لإظهار تنفيذ FLIM في سير عمل متعدد الآبار الآلي.
- لتوفير إجراء مفصل لاكتساب بيانات FLIM.
- لعرض مزايا استخدام البرمجيات مفتوحة المصدر لاكتساب البيانات وتحليلها.
الطرق المستخدمة
- استخدام برنامج µManager للتحكم في الأداة.
- تحليل البيانات باستخدام FLIMfit.
- معايرة صندوق التأخير وضبط المعلمات البصرية.
- اكتساب صور عمر الفلورة من لوحات متعددة الآبار.
النتائج الرئيسية
- اكتساب ناجح لبيانات FLIM من آبار مختلفة.
- أظهرت آبار التحكم السلبية أطول فترات عمر.
- تباين متوسطات فترات العمر عبر لوحات متعددة الآبار، مما يشير إلى اختلافات في هياكل FRET.
- التحقق من صحة نماذج الملاءمة من خلال تحليل الاضمحلال أحادي الأس.
الاستنتاجات
- تقيس أداة openFLIM-HCA تفاعلات البروتين بشكل فعال.
- تعزز مسارات العمل الآلية بشكل كبير من قدرات اكتساب البيانات.
- يوفر FLIM رؤى قيمة حول العمليات الخلوية والتفاعلات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) in multiwell plate format enables robust, quantitative readouts of protein interactions via FRET, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The open-source workflow reduces barriers to adoption, allowing R&D teams to generate reproducible interaction data across compound libraries or genetic perturbations. This positions the method as a scalable, cost-effective tool for lead identification and portfolio triage in mechanistic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying FRET-based protein interaction dynamics in live or fixed cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through population fraction analysis of interaction states from single-exponential decay fitting.
- Predictive Value: Provides lifetime changes down to 20 picoseconds, allowing detection of subtle interaction shifts critical for lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline FRET efficiency in multiwell plate format.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs via automated acquisition of thousands of cells across hundreds of fields of view.
- Scalability: Facilitates platform reuse for screening oligomerization, heterodimerization, or intramolecular biosensor readouts in drug discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through live-cell FRET biosensor time courses, enabling dynamic pathway monitoring.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by providing consistent, quantitative interaction metrics across model systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria via FLIM-derived interaction population fractions and lifetime shifts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling quantitative assessment of protein interactions prior to preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via FRET readouts of protein oligomerization or biosensor activation.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through automated multiwell plate acquisition and global analysis of FLIM data.
- Analytics: Generates quantitative lifetime measurements and population fractions using FLIMfit for condition comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects to preclinical work through live-cell FRET biosensor dynamics, preserving mechanistic context.
- Enterprise Reuse: Positions the open-source FLIM-HCA platform as a reusable capability for repeated screening cycles across targets and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement, reduction of mechanistic ambiguity in protein interaction assays.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of FRET-based readouts across multiwell plate formats.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early interaction validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative interaction thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, FLIM principles, and open-source software (µManager, FLIMfit).
- Needs instrumentation including laser source, delay generator, gated optical intensifier, and spinning disk confocal unit.
- Demands cross-team standardization for calibration, acquisition parameters, and analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different fluorescent protein pairs, linker lengths, and cellular expression systems.
- Includes practical limitations such as laser safety protocols and the need for background and reference data acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Open Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM)–High Content Analysis (HCA) Plugin Setup
1:51
Instrument Response Function (IRF) Image and Reference Dye Data Acquisition
4:32
Multiwell Plate Sample FLIM Data Acquisition
6:29
Results: Representative FLIM Analyses in Cos and HeLa Cells
8:05
Conclusion
![تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56279.jpg%3Fv%3D2026-07-04T00%253A28%253A46.000Z&w=384&q=75)
