عزل السريع لBMPR-IB + الدهنية المشتقة الخلايا اللحمية للاستخدام في قبي عيب شفاء نموذج

الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل مجموعات خلوية محددة من الخلايا السدوية المشتقة من الأنسجة الدهنية، واختبار نشاطها المكون للعظم باستخدام مقايسة داخل الجسم الحي. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا التجدد القحفي الوجهي، مثل كيفية استخدام الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية لإنشاء أنسجة عظمية وظيفية بالكامل في عيوب العظام المتضررة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي عزل الخلايا بسرعة من أنسجة بشرية طازجة، وبهذه الطريقة تتجنب الخلايا قضاء وقت في المزرعة الخلوية، وهو الأمر المعروف بأنه يغير التعبير الجيني ومؤشرات الخدمة الخلوية.

تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل المرضى الذين يعانون من عيوب عظمية كبيرة، الناتجة عن السرطان أو الصدمات أو العدوى. وقد يكون من الممكن في المستقبل عزل مجموعات خلوية من ASCs واستخدامها بطريقة تجديدية. ويعد العرض المرئي لهذه التقنية أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم كيفية إنشاء العيب في القحف، ويرجع ذلك أساساً إلى أن العيب يتم إنشاؤه في جمجمة مقوسة، ولأنه يكون قريباً جداً من الأم الجافية.

لهذا البروتوكول، يتم جمع الدهون تحت الجلد من منطقة البطن أو الخاصرة أو الفخذ من متبرع بشري سليم، وتُخزن في وعاء شفط بلاستيكي. أضف إلى الدهون حجماً مساوياً من محلول PBS المعقم، واخلطه عن طريق الرج الخفيف لمدة 30 ثانية. اترك الطبقة المائية حتى تستقر، ثم قم بإزالتها باستخدام ماصة بلاستيكية سعة 10 milliliter.

بعد ذلك، يتم سكب الدهون في حاوية بلاستيكية كبيرة، وإضافة حجم مساوٍ من خليط الهضم. يتم تنظيف حاوية الدهون المغلقة باستخدام 70% ethanol، وإغلاقها بالشمع (paraffin). ثم تُرج الحاوية بسرعة 180 دورة في الدقيقة، في حاضنة بدرجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، قم بمعادلة عملية الهضم عبر مضاعفة حجم التفاعل باستخدام وسط قياسي. قم بطرد الخلايا مركزياً، وأزل السائل الطافي بعناية، ثم أعد تعليق كل راسب في 5 milliliters من وسط قياسي. بعد ذلك، مرر جميع المعلقات عبر مرشح 100 micron إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

قم بطرد الرشاحة مركزياً عند درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة بسرعة 300 G. تخلص من الطافي وأعد تعليق الراسب في 5 mL من منظم تحلل كريات الدم الحمراء (RBC lysis buffer) في درجة حرارة الغرفة. وبمجرد تكوين المعلق، اترك العينة لمدة 5 دقائق للتحلل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب مركزياً في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، وأكمل خطوات الفصل وفقاً للبروتوكول النصي.

يعد فرز الخلايا بشكل صحيح أمراً بالغ الأهمية في هذا البروتوكول. أولاً، أعد تعليق الخلايا في منظم FACS بتركيز مليون خلية لكل 100 µL، واحفظها على الثلج. بعد ذلك، انقل ما لا يقل عن 10 مليون خلية إلى أنبوب طرد مركزي بلاستيكي على الثلج ومكتوب عليه BMPR-1B.

انقل مليون خلية إلى أنبوب على الثلج مُصنف باسم "غير مصبوغة" (unstained)، وأضف إليها واحد ملليلتر من منظم FACS. صنف الخلايا المتبقية باسم "غير مفروزة" (unsorted). بعد ذلك، أضف الجسم المضاد إلى أنبوب BMPR-1B وامزجه عن طريق السحب والضخ اللطيف للمحلول (trituration) لضمان التجانس.

اترك هذا الخليط ليتحضن للمدة التي اقترحها المصنّع. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً من أجل فرز FACS، وأعد تعليقها بعناية في 1 mL من منظم FACS. ثم، كرر العملية وأعد تعليق الخلايا بتركيز مليون خلية لكل 1 mL.

الآن، قم بتمرير المجموعات الخلوية الثلاث عبر مصفاة خلايا بمسام 40 ميكرون إلى أنابيب FACS زجاجية. استخدم 500 microliters من منظم FACS لشطف آخر الخلايا من المصافي. الآن، جهز أنبوبي تجميع، أحدهما للمجموعات الإيجابية للأجسام المضادة والآخر للمجموعات السلبية.

املأ كل أنبوب بـ 2 mL من وسط زراعة الخلايا القياسي، وفي جهاز FACS، قم أولاً بتشغيل الخلايا غير المصبوغة، واستخدم النتائج لتحديد بوابة سلبية للمؤشر الفلوري. بعد ذلك، وباستخدام فوهة بحجم 100 ميكرون، قم بفرز الخلايا المصبوغة في الأنابيب المخصصة لها والتي تحتوي على الوسط القياسي. وإذا كان ذلك ممكناً، حافظ على تبريد هذه الأنابيب عند 4 °C أثناء عملية الفرز.

تابع العملية بتحميل الخلايا في السقالة كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد تخدير الحيوان، قم بقص أي شعر من موقع الجراحة وافرك الجلد المكشوف بمحلول بوفيدون أيودين متبوعاً بـ 70%ethanol، ثلاث مرات. بعد ذلك، قم بتغطية الحيوان بملاءة جراحية، مع ترك موقع الجراحة مكشوفاً.

الآن، باستخدام مبضع ذو شفرة رقم 15، قم بإجراء شق سهمي في الخط المتوسط يمتد عبر معظم الجزء الظهري من الجمجمة. بعد ذلك، وباستخدام ملاقط دقيقة الأسنان، قم بسحب الجلد على الجانب الأيمن من الشق لكشف العظم الجداري الأيمن. قم بتجهيز المثقاب باستخدام لقمة مثقاب ثقب (trephine) ذات طلاء ماسي بقطر 4 ملم ومعقمة بجهاز الأوتوكلاف.

بعد ذلك، قم بعمل ثقب في العظم الجداري، ولكن لا تمدد الثقب لما بعد العظم، واترك طبقة الأم الجافية دون مساس. الآن، ضع سِقالة تحتوي على خلايا أو محلول تحكم في الثقب، وأغلق شق الجلد بغرزة نايلون مستمرة. ثم، تابع بروتوكولات رعاية الفئران بعد العملية الجراحية كما هو موضح في البروتوكول النصي.

تظهر فحوصات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro CT) لعيب الجمجمة، والتي أُجريت في يوم الجراحة، العيب الجديد بوضوح. وتظهر الفحوصات المتكررة في نقاط زمنية لاحقة أن العيوب التي زُرعت بخلايا إيجابية لـ BMPR-1B تلتئم بسرعة أكبر من تلك المزروعة بخلايا سلبية لـ BMPR-1B، أو خلايا غير مفروزة. وعندما يتم قياس الالتئام كنسبة مئوية لإغلاق الجرح الكامل، يكون الفرق واضحاً تماماً.

بعد ذلك، تم إزالة الكالسيوم من أجزاء الجمجمة التي تحتوي على العيوب وصبغها لتحديد العظم المتجدد الجديد والمسيطر باستخدام صبغة موفات خماسية الألوان (Movat's pentachrome)، والتي تميز الغضروف عن العظم وجميع مراحل النضج التي تقع بينهما. وبمقارنتها بالخلايا غير المصنفة، أظهرت الخلايا الموجبة لـ BMPR-1B تأثيراً قوياً على عملية التجديد، وكان ذلك ملحوظاً بشكل أكبر على طول حدود العيب. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد للإمكانات السريرية التي تنطوي عليها هذه التجربة في عزل الخلايا الجذعية الوسيطة (ASCs) الخاصة بالمريض واستخدامها لعلاج عيوب العظام.

يمكن أن تنبثق عن هذا العديد من التجارب اللاحقة للإجابة على المزيد من الأسئلة المتعلقة بالتئام العظام، مثل استخدام تقنية FACS لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة (ASCs) ذات الالتزامات السلالية المختلفة، والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro CT) لتحليل كيفية التئام أنواع الخلايا والأنسجة المختلفة بمرور الوقت، واستخدام نموذج العيب القحفي في هذه التجربة لابتكار المزيد من تجارب التئام العظام. لا تنسَ أن العمل مع الأنسجة البشرية قد يكون خطيراً للغاية؛ لذا تأكد من اتخاذ الاحتياطات المناسبة، بما في ذلك ارتداء القفازات، واستخدام واقي العينين، والتخلص من جميع النفايات الخطرة بشكل صحيح.