المناعية على أقسام البارافين للبشرة باستخدام الماوس أجسام نيون

في البشرة. الكيمياء المناعية هي وسيلة فعالة لتوطين بروتينات معينة في حجرة التعبير الخاصة بها. في هذا الفيديو ، نوضح طريقة موثوقة للتوطين المناعي للبروتين في البشرة ، والتي نستخدمها بشكل روتيني في مختبرنا.

مرحبا ، أنا تامي من مختبر الدكتور تورينو هنا في المبنى المنخفض لمعهد أوتاوا للبحوث الصحية في برنامج الأمراض المزمنة. سنعرض لكم اليوم إجراء للكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة الفلورية على أقسام الأنسجة المدمجة في البارافين في بشرة الفئران. في مختبرنا ، قمنا بتحسين بروتوكولات تحديد موقع تمايز البشرة المناعي باستخدام الأنسجة الثابتة BO.

كجزء من التحسين ، نحافظ على الجلد مسطحا عن طريق وضعه على منشفة ورقية قبل تثبيته. يتضمن هذا الإجراء تشريح تثبيت البشرة ، والجفاف ، وتضمين البارافين ، وقطع القسم de الشمع ، وكشف مستضد الجفاف ، ووضع العلامات على الأجسام المضادة ، وأخيرا التركيب والتصور باستخدام مضان epi. لذلك دعونا نبدأ.

عند استخدام الفئران حديثي الولادة ، ليست هناك حاجة لحلاقة الجلد الخلفي. ومع ذلك ، عندما يكون لديك فئران أكبر سنا لديها فراء ، فأنت بحاجة إلى حلق جلد الظهر بعيدا حتى لا يعيق قطع الأقسام. عندما تقوم بتشريحك ، فأنت تريد أن تكون حريصا جدا على عدم وضع ملقطك في مناطق الجلد التي تريد استخدامها في الفحص.

لذا ما نفعله هو أننا نضع الملقط حول حافة المكان الذي سنقطعه فيه ، ثم ترفع بعناية فائقة ، وتقطع البشرة ، وتتذكر عدم لمس المنطقة التي تريد استخدامها في تجربتك. عندما نقوم بإصلاح الجلد ، لا نريد أن يتدحرج الجلد ويكون في الأنبوب. نريدها أن تكون لطيفة ومسطحة.

لذا ما نفعله من أجل المساعدة في ذلك هو أن نضع الجلد على منشفة ورقية بحيث يظل مسطحا أثناء إصلاحه. والآن بعد أن أصبح الجلد لطيفا ومسطحا على المنشفة الورقية ، ما نفعله هو قطع الحواف أو تقليمها لإزالة الأجزاء التي ربما أتلفناها بالملقط. ثم تقطع الجلد إلى قطع صغيرة جدا حوالي ملليمترين في ملليمترين.

الآن سيتم إصلاح الأنسجة. بعد تقطيع الجلد إلى قطع يمكن التحكم فيها ، يمكنك غمره في محلول boin. قم بتغطية الأنابيب ، ولف الأنابيب بالبيرفيل وضعها على هزاز.

للحضانة بين عشية وضحاها ، من المهم احتضان محلول boin لمدة 16 إلى 18 ساعة فقط. ستؤدي فترات التثبيت الأقصر أو الأطول إلى إتلاف أنسجتك. انتهت الحضانة.

تشطف أنسجتك باستخدام PBS ثم من خلال سلسلة من غسول الإيثانول باستخدام 30٪ و 50٪ و 70٪ كحول. يمكنك أن ترى أن BO أصفر اللون وأنه أثناء قيامك بالغسالات ، مع تخفيف النعم ، يصبح لون الغسيل أقل وأقل أصفر. تغسل مرتين 30 دقيقة في كل مرة.

بعد الغسيل الأخير في عينات الإيثانول ، توضع في 70٪ من الإيثانول الطازج ويمكن تخزينها عند أربع درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة لبضع فتحات من البارافين. تضمين. الإفراط في استخدام الأنسجة المجمدة هو أن سلامة الأنسجة متفوقة ويمكن تخزين العينات لفترات طويلة من الزمن. بشكل عام ، تولد المرافق الأساسية نتائج أكثر قابلية للتكرار.

ومع ذلك ، إذا كان لديك منشأة ومشغل مخصص لديه الخبرة ، فيمكن قطع الأقسام داخليا. تعلم قطع الأقسام الجيدة هو بالأحرى شكل من أشكال الفن. لذلك ، نستخدم منشأة أساسية.

بعد استلام الشرائح مرة أخرى من المنشأة الأساسية ، يمكنك أن ترى أن البارافين موجود على الشرائح. كغشاء رقيق ، توضع الشرائح على رف ملفوف بورق الألمنيوم ، تماما مثل البطاطس المخبوزة وتحتضنها لمدة خمس دقائق عند 55 درجة. بعد انتهاء الحضانة ، قم بفك الشرائح بسرعة وضع الشرائح في التولوين لمدة ثلاث غسلات مدة كل منها خمس دقائق.

من المهم جدا أن تتذكر أن هذه الغسالات التي تبلغ مدتها خمس دقائق يجب أن تكون في الوقت المناسب ، وتحتضن لفترة طويلة جدا ، ولن يكون التولوين مفيدا لعيناتك. بعد الغسلات الثلاث والتولوين ، قم بشطف سريع في مائة بالمائة من الإيثانول. نظرا لأن الإيثانول والتولوين يشكلان راسب يتداخل مع تجربتك ، فهذه خطوة مهمة جدا يجب تذكرها.

بعد ذلك ، يتم إعادة ترطيب العينات عن طريق احتضان الشرائح ، خمس دقائق في 95٪ إيثانول ، خمس دقائق ، 70٪ إيثانول ، ثم مرتين في خمس دقائق في الماء. في هذه المرحلة ، يمكن معالجة الأنسجة للتلوين باستخدام h و e. نستخدم أيضا المرفق الأساسي لهذا الغرض.

للمستضد ، كشف 500 مل فقير من مخزن السترات لمرة واحدة في دورق بلاستيكي سعة لتر واحد واغمر الشرائح. تذكر إزالة المقبض المعدني ووضع الدورق في الميكروويف. الميكروويف بقوة عالية لمدة مرتين خمس دقائق.

تذكر أن تفتح الباب لتبريد الميكروويف بين حضانتيك. بعد الانتهاء من الميكروويف ، قم بإزالة الشرائح من مخزن السترات المغلي وضعها في طبق تلطيخ يحتوي على ماء دافئ. نحن نستخدم فقط ماء الصنبور الدافئ والغرض من ذلك هو تبريد الشرائح ببطء من الغليان إلى درجة حرارة الغرفة.

يمكنك الآن غسل الشرائح ثلاث مرات خمس دقائق في PBS ونحن على استعداد للبدء في الكيمياء المناعية. أول شيء يتعين علينا القيام به لبدء التلوين المناعي هو تجفيف المنطقة المحيطة بعيناتنا بقطعة من المناديل الورقية. من أجل منع التلوث المتبادل للأجسام المضادة ، نقوم بترسيم المنطقة المحيطة بعيناتنا باستخدام مانع السوائل.

قم بإعداد غرفة رطبة عن طريق وضع ورق ترشيح في طبق بتري. انقعها بالماء ، وقم بإزالة الماء الزائد وأدخل الشرائح. السبب في استخدامنا للغرفة المرطبة هو التأكد من أنه خلال فترات الحضانة لدينا لا تجف شرائحنا.

من المهم جدا ألا تجف الشرائح لأن الرسم سيزيد من خلفيتك. يتم حظر الشرائح في هذا الوقت مع مخزن مؤقت للحضانة لمدة 30 دقيقة. بعد الحظر ، انقل الشرائح مرة أخرى إلى رف الشرائح واحتضانها في مخزن الغسيل.

قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد تماما كما فعلت من قبل. ضع الشريحة مرة أخرى في الغرفة المرطبة واحتضن بالجسم المضاد الأساسي لمدة ساعة واحدة. في درجة حرارة الغرفة.

عندما تنتهي فترة الحضانة لمدة ساعة واحدة ، ضع الشرائح مرة أخرى في رف الشرائح واغسلها بمخزن غسيل لمدة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل ، قم بإزالة مخزن الغسيل الزائد من حول العينة باستخدام مناديل ورقية. ضع الشرائح مرة أخرى في الغرفة المرطبة واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بجسم مضاد ثانوي بعد الحضانة بالجسم المضاد الثانوي ، واغسلها في ثلاثة تغييرات من مخزن الغسيل المؤقت لمدة 15 دقيقة لكل منهما.

بعد ذلك ، نغسل في ثلاث مرات خمس دقائق. في PBS ، قم بإزالة أي سوائل زائدة تحيط بالعينة وامسح PBS بعيدا عن الجزء الخلفي من الشريحة لتركيب زلات الغطاء على الشريحة. نحن نستخدم الهاتف المحمول مع 2.5٪ DAB co.

لتقليل التلاشي ، أضف 80 ميكرولترا من القطرة إلى الشرائح. الحرص على عدم إدخال أي فقاعات. ثم انخفض ببطء شديد على زلة الغطاء.

الحرص على عدم ترك أي فقاعات وراءك. الفقاعات سيئة لأنها غالبا ما تهبط مباشرة على عينتك ، حيث تريد التقاط صورك مباشرة بعد جفاف هاتفك المحمول. أنت الآن جاهز للذهاب انظر إلى الشرائح الخاصة بك.

فيما يلي نظرة على تلطيخ ناجح باستخدام مرشح FITC. في هدف 20 × ، نرى Clain six مرتبطا بجميع الطبقات القاعدية الفائقة للبشرة. مختبرنا مهتم جدا بالتعبير عن الكلودينات وتوطينها في البشرة.

فيما يتعلق بالتقاطعات الضيقة وتشكيل حاجز نفاذية البشرة ، فقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء الكيمياء المناعية على جلد الفأر. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنك تريد أن تكون أقسام الأنسجة مسطحة وأنك تريد التأكد من أن الشرائح لا تجف بين الحضانات. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.