المناعية على أقسام البارافين للبشرة باستخدام الماوس أجسام نيون

في البشرة. يعد الكيمياء النسيجية المناعية وسيلة فعالة لتحديد موقع بروتينات معينة في حجيرة تعبيرها. في هذا الفيديو، نستعرض طريقة موثوقة للتوطين المناعي للبروتين في البشرة، وهي طريقة نستخدمها بشكل روتيني في مختبرنا.

مرحباً، أنا تامي من مختبر الدكتور تورين هنا في المبنى المنخفض بمعهد أوتاوا لأبحاث الصحة ضمن برنامج الأمراض المزمنة. سنعرض لكم اليوم إجراءً للكيمياء النسيجية المناعية باستخدام أجسام مضادة فلورية على مقاطع نسيجية من بشرة الفأر مثبتة في البرافين. لقد قمنا في مختبرنا بتحسين البروتوكولات الخاصة بالتحديد المناعي لمواقع علامات التمايز البشروي باستخدام أنسجة مثبتة بـ BO'S.

كجزء من عملية التحسين، نحافظ على استواء الجلد عن طريق فرده على مناديل ورقية قبل التثبيت. تتضمن هذه العملية تشريح البشرة، والتثبيت، وإزالة الماء، والطمر في البرافين، وتقطيع المقاطع، وإزالة الشمع، وإعادة الترطيب، وكشف المستضد، ووسم الأجسام المضادة، وأخيرًا التثبيت على الشريحة والتصوير باستخدام الفلورة فوق البؤرية. لذا، دعونا نبدأ.

عند استخدام الفئران حديثة الولادة، لا داعي لحلاقة جلد الظهر. ومع ذلك، عندما تستخدم فئران أكبر سناً يكسوها الفراء، يجب حلاقة جلد الظهر حتى لا يعيق عملية قطع المقاطع. عند إجراء عملية التشريح، يجب توخي الحذر الشديد لتجنب وضع الملقط في مناطق الجلد التي تنوي استخدامها في المقايسة.

لذا، ما نقوم به هو وضع الملقط حول حافة المنطقة التي سنقوم بقصها، ثم نرفع بحذر شديد، ونقص البشرة، مع التذكر بعدم لمس المنطقة التي ترغب في استخدامها في تجربتك. وعندما نقوم بتثبيت الجلد، فإننا لا نريد أن يلتف الجلد ويكون داخل الأنبوب، بل نريده أن يكون مسطحاً تماماً.

لذا، ومن أجل المساعدة في ذلك، نقوم بوضع الجلد على منشفة ورقية ليبقى مسطحاً أثناء عملية التثبيت. والآن، وبعد أن أصبح الجلد مسطحاً تماماً على المنشفة الورقية، نقوم بقص الحواف أو تهذيبها لإزالة الأجزاء التي قد نكون قد أتلفناها باستخدام الملقط. بعد ذلك، يتم تقطيع الجلد إلى قطع صغيرة جداً بحجم 2 millimeter × 2 millimeter تقريباً.

سيتم الآن تثبيت النسيج. بعد تقطيع الجلد إلى قطع يمكن التعامل معها، قم بغمره في محلول boin. أغلق الأنابيب بإحكام، ولفها بورق perfil، ثم ضعها على جهاز الهزاز (rocker).

بالنسبة للتحضين طوال الليل، من المهم التحضين في محلول boin لمدة تتراوح بين 16 إلى 18 ساعة فقط. حيث أن فترات التثبيت الأقصر أو الأطول ستؤدي إلى تلف الأنسجة. وبذلك ينتهي التحضين.

يتم شطف النسيج بمحلول PBS، ثم عبر سلسلة من غسلات الإيثانول باستخدام كحول بتركيزات 30% و50% و70%. يمكنك ملاحظة أن الـ BO يتميز بلون أصفر، ومع إجراء عمليات الغسل وتخفيف الـ boons، يصبح لون سائل الغسل أقل اصفراراً تدريجياً. يتم الغسل مرتين، لمدة 30 دقيقة في كل مرة.

بعد الغسلة الأخيرة في الإيثانول، تُوضع العينات في إيثانول بتركيز 70% جديد، ويمكن تخزينها عند درجة حرارة 4 °C حتى معالجتها لاحقاً في شمع البارافين. ويُعد استخدام الأنسجة المجمدة مفيداً لأن سلامة الأنسجة تكون أفضل ويمكن تخزين العينات لفترات زمنية طويلة. وبشكل عام، تحقق المرافق المركزية نتائج أكثر قابلية للتكرار.

ومع ذلك، إذا توفرت لديك المنشأة والمشغل المختص الذي يمتلك الخبرة اللازمة، فيمكن إجراء القطاعات داخلياً. إن تعلم كيفية قطع قطاعات جيدة يُعد بمثابة فن بحد ذاته؛ لذا، فإننا نعتمد على منشأة مركزية متخصصة.

بعد استلام الشرائح من المرفق المركزي، ستلاحظ وجود البارافين على الشرائح. وبما أنها على شكل غشاء رقيق، توضع الشرائح على حامل ملفوف بورق ألومنيوم، تماماً مثل طريقة لف البطاطس المخبوزة، ثم تُحضن لمدة خمس دقائق عند 55 درجة. وبعد انتهاء فترة التحضين، قم بإزالة ورق الألومنيوم عن الشرائح بسرعة وضعها في التولوين لثلاث غسلات مدة كل منها خمس دقائق.

من المهم جداً تذكر أن عمليات الغسل التي تستغرق خمس دقائق يجب أن تكون مؤقتة بدقة، لأن التحضين لفترة طويلة أو التعرض للتولوين سيؤثر سلباً على العينات. بعد إجراء عمليات الغسل الثلاث ومعالجة التولوين، قم بعملية شطف سريعة باستخدام إيثانول بتركيز 100%. ونظراً لأن الإيثانول والتولوين يشكلان راسباً من شأنه أن يتداخل مع تجربتك، فإن هذه الخطوة مهمة جداً ويجب تذكرها.

بعد ذلك، يتم إعادة ترطيب العينات عن طريق تحضين الشرائح لمدة خمس دقائق في 95%ethanol، ثم خمس دقائق في 70%ethanol، ثم مرتين لمدة خمس دقائق في الماء. وفي هذه المرحلة، يمكن معالجة الأنسجة للتلوين بـ h و e. كما نستخدم المرفق المركزي لهذا الغرض.

من أجل كشف المستضدات، اسكب 500 mils من محلول السترات المنظم أحادي المرة في دورق بلاستيكي سعة لتر واحد واغمر الشرائح فيه. تذكر إزالة المقبض المعدني ووضع الدورق في الميكروويف. قم بالتشغيل في الميكروويف على طاقة عالية لمدة خمس دقائق مرتين.

تذكر فتح باب الميكروويف لتبريده بين فترتي التحضين. بعد الانتهاء من التسخين بالميكروويف، قم بإزالة الشرائح من محلول منظم السترات المغلي وضعها في طبق صبغ يحتوي على ماء دافئ. نحن نستخدم ماء الصنبور الدافئ، والغرض من ذلك هو تبريد الشرائح ببطء من درجة الغليان إلى درجة حرارة الغرفة.

يمكنكم الآن غسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في PBS، وبذلك نكون مستعدين للبدء في عملية الكيمياء النسيجية المناعية. أول شيء نحتاج إلى القيام به لبدء الصبغ المناعي هو تجفيف المنطقة المحيطة بالعينات باستخدام قطعة من ورق المناديل. ومن أجل منع التلوث الخلطي للأجسام المضادة، نقوم بتحديد المنطقة المحيطة بالعينات باستخدام حاجب سائل.

قم بتجهيز غرفة ترطيب عن طريق وضع ورقة ترشيح في طبق بتري. بللها بالماء، ثم تخلص من الماء الزائد وضع الشرائح بداخلها. والسبب في استخدام غرفة الترطيب هو ضمان عدم جفاف الشرائح خلال فترات الحضن.

من المهم جداً ألا تجف الشرائح لأن الجفاف سيزيد من مستوى الخلفية. يتم حجب الشرائح في هذه المرحلة باستخدام محلول الحجب لمدة 30 دقيقة. بعد الحجب، قم بنقل الشرائح مرة أخرى إلى حامل الشرائح وتحضينها في محلول الغسيل.

قم بإزالة المحلول المنظم الزائد تماماً كما فعلت سابقاً. أعد الشريحة إلى الغرفة الرطبة واتركها لتحضن مع الجسم المضاد الأولي لمدة ساعة واحدة، في درجة حرارة الغرفة.

عند انتهاء فترة الحضن التي تستغرق ساعة واحدة، أعد الشرائح إلى حامل الشرائح واغسلها بمحلول الغسيل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد عمليات الغسل، قم بإزالة محلول الغسيل الزائد من حول العينة باستخدام ورق نشاف. أعد الشرائح إلى غرفة الترطيب واحضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الجسم المضاد الثانوي، وبعد الحضن مع الجسم المضاد الثانوي، اغسلها بثلاث تغييرات من محلول الغسيل لمدة 15 دقيقة لكل منها.

بعد ذلك، نقوم بالغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. في محلول PBS، يتم إزالة أي سوائل زائدة تحيط بالعينة ومسح محلول PBS من ظهر الشريحة لتثبيت أغطية الشرائح على الشريحة. نستخدم محلول DAB بتركيز 2.5%.

من أجل تقليل البهتان، أضف 80 µL قطرة تلو الأخرى إلى الشرائح، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات. ثم أنزل غطاء الشريحة ببطء شديد.

احرص على عدم ترك أي فقاعات هواء. تُعد الفقاعات مشكلة لأنها غالبًا ما تستقر مباشرة فوق العينة، وهو المكان الذي ترغب في التقاط الصور منه بعد جفاف الهاتف المحمول. الآن، أنت مستعد للبدء؛ افحص الشرائح الخاصة بك.

إليكم نظرة على عملية صبغ ناجحة باستخدام مرشح FITC. عند استخدام عدسة شيئية بقوة 20x، نلاحظ وجود Clain six مرتبطاً بجميع الطبقات فوق القاعدية للبشرة. يولي مختبرنا اهتماماً كبيراً بالتعبير عن البروتينات الرابطة "claudins" وتحديد مواقعها في البشرة.

فيما يتعلق بالوصلات المحكمة وتكوين حاجز النفاذية البشروي، فقد أوضحنا لكم للتو كيفية إجراء الكيمياء النسيجية المناعية على جلد الفأر. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة أن تكون قطاعات الأنسجة مسطحة، والتأكد من عدم جفاف الشرائح بين فترات التحضين. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.