Name: حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا في المختبر من البروتينات النسخ المتماثل الجراثيم T7 (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: اكتشف حركيات تخليق الحمض النووي المتخلفة الحبلا باستخدام بروتينات النسخ المتماثل للجرثومة T7. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة تكوين البرايمرات ونقلها إلى بوليميراز DNA بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر أعضاء مختبر C.C.R. على التعليقات و S. Moskowitz على إعداد الشكل. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية F32GM101761 (A.J.H.) و GM54397 (C.C.R.).

ملاحظة: اتبع جميع الأنظمة المؤسسية بشأن الاستخدام الآمن والتخلص من المواد المشعة، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر، واستخدام معدات الوقاية الشخصية، مثل القفازات، ونظارات السلامة، معطف المختبر، والدروع الاكريليك المناسبة. ملاحظة: يتكون عازلة معيار من 40 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي الغلوتامات البوتاسيوم، 5 ملي DTT و 0.1 ملي EDTA (ومسبقة الصنع هذا المخزن المؤقت عند تركيز 5X) و 0.3 ملم من كل dNTP. ويتم تنقية البروتينات تكرار T7 كما هو موضح 8 و 9 و 10. الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد يحتوي على واحد T7 الموقع الاعتراف بريميز (5&#39;-GGGTC-3 &quot;، 5&#39;-GTGTC-3&quot;، 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من الشركات توليف الحمض النووي (طول وssDNA قد تعتمد على انزيم الاختيار، لبريميز T7، وهو مخموس هو الحد الأدنى لطول قالب لتجميع التمهيدي كامل طول 11، كما خفي C ضروري، ولكن إذا التمهيدي هو للتمديد من قبل البلمرة، يجب أن يكون النيوكليوتيدات إضافية موجودة في نهاية 3 &#39;من القالب. وبدأت ردود الفعل من خلال إضافة تركيز النهائي من 10 ملي MgCl 2 وحضنت عند 25 درجة مئوية. أخذ العينات اليدوية تعمل بشكل جيد لفترة نقاط من 5 ثوان أو أكثر. إذا كانت هناك حاجة للوقت نقطة أقصر من ذلك، فمن المستحسن استخدام أداة تدفق إخماد السريع للحصول على بيانات دقيقة. 1. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل من جانب أخذ العينات اليدوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل بدء التجربة، قسامة 2 ميكرولتر من العازلة صبغ الفورماميد (93٪ (ت / ت) الفورماميد، 50 ملي EDTA، 0.01٪ سيانول زايلين و 0.01٪ برموفينول الأزرق) إلى 8 1.5 أنابيب البولي بروبلين مل. بشكل عام، وعدد من الأنابيب هو مساو لعدد من الزمن نقاط تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير خليط 20 ميكرولتر تتكون 1X العازلة، 0.1 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP، 0.25 زارة التجارة والصناعة / مل [α- 32 ف] CTP، 0.1 ميكرومتر SSDقالب NA، و 0.1 ميكرومتر GP4 (معبرا عنها تركيز مسدوس - 0.6 ميكرومتر مونومر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 2 ميكرولتر من الخليط باستخدام pipettor وتخلط مع 2 ميكرولتر عازلة صبغ الفورماميد في أنبوب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1 لأي ​​السيطرة على رد فعل (الساعة صفر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من 0.1 M MgCl 2 إلى خليط التفاعل (لتركيز النهائي من 10 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب يدويا 2 عينات ميكرولتر من خليط التفاعل باستخدام pipettor في الصورة فترات 10 وتخلط مع صبغ الفورماميد predispensed في أنابيب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل aliquots من العينات على هلام تغيير طبيعة. يتم حل المنتجات التمهيدي tetraribonucleotide صغيرة توليفها من قبل بريميز T7 جيدا على 0.4 مم 25٪ الأكريلاميد: bisacrylamide (19: 1)، 3 M اليوريا، 1X TBE (100 ملي تريس، بورات، 1 ملم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل بالكامل على chromatograورقة فيز والغطاء مع غلاف بلاستيكي. هلام الجافة باستخدام أكثر جفافا هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة تخفيف ما تبقى من خليط التفاعل وبقعة نفس حجم تحميلها على هلام على ورقة اللوني، أي بقعة 4 ميكرولتر من التخفيف إذا تم تحميل 4 ميكرولتر من العينة. ملاحظة: وهذا سيكون بمثابة منحنى القياسية لتحديد تركيز شكلت المنتجات أثناء عملية التفاعل. على سبيل المثال، التخفيفات خمسة أضعاف باستخدام العازلة TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) تعمل بشكل جيد، تغطي مجموعة من 1:25 إلى 1: 15625 (5 2 -5 6)، ولكن يجب أن التخفيفات تعديلها تبعا لمستوى النشاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح هلام الجافة ومستوى باستخدام شاشة phosphorimager. قياس النشاط الإشعاعي في سلسلة تخفيف وبناء منحنى القياسية كما هو موضح 8 و 12 ملاحظة: إدراج T7 البلمرة DNA لخليط التفاعل يسمح احد لإكساءمنجم استخدام بادئات tetraribonucleotide هذا الانزيم. على النحو الأمثل، وتركيز البلمرة يجب أن تشبع لتبسيط تفسير البيانات. وهناك تركيز البلمرة من 0.4 ميكرومتر أو أعلى يعطي نتائج جيدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير بروتينات أخرى، مثل الحمض النووي ملزمة البروتينات واحدة الذين تقطعت بهم السبل، على أي توليف التمهيدي أو متخلفة حبلا بدء يمكن فحص بهذه الطريقة. </li></ol> 2. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل عن طريق صك السريع-إخماد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخاليط رد فعل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X و 0.2 ميكرومتر GP4 مسدوس، 0.2 ميكرومتر قالب ssDNA، 0.6 ملي dNTPs، 0.2 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP (بما في ذلك 0.5 MCI / مل [α- 32 ف] CTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل-إخماد السريع أداة تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل موسيقى الرابID-إخماد أداة التدفق. بعد ظهور القائمة الرئيسية، اكتب 7 على لوحة المفاتيح أداة لنقل سائق المحقنة إلى موقف البيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة موقف فتح عازلة ل&quot;تحميل&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحاقن العازلة تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق 10 مل حقنة تحتوي عازلة لميناء محرك حقنة. تغيير حقنة موقف مقبض الباب ل&quot;تحميل&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن طريق الحقن 10 مل، وملء عازلة أداة خزان A و B مع 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA وملء حقنة C مع حل إخماد (250 ملي EDTA، و 0.2٪ SDS). إزالة فقاعات الهواء عن طريق دفع الغطاسون في الداخل والخارج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواقف تغيير مقبض الباب ل&quot;النار&quot;. النوع 2 لضبط الموقف من شريط سائق حقنة. الصحافة .. &quot;تعديل أسفل&quot; الزر لخفض حقنة حتى يأتي عازلة خارج الحلقة الخروج: (7 تنخفض باستمرار؛ الخطوة 8 الكبيرة إلى أسفل؛ الخطوة 9 صغيرة أسفل). اكتب &quot;ESC&quot; للعودة إلى القائمة الرئيسية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنابيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توريمنظمة العمل ضد الجوع خط الخروج إلى فراغ. تغيير المقابض عينة إلى &quot;إخراج&quot;. وثيقة حقنة عازلة عن طريق وضع المقابض إلى الوضع الأفقي. بدوره على فراغ وتراجع الحلقات 2 دافق في H 2 O لمدة 10 ثانية، ثم تراجع في MeOH لمدة 10 ثانية. حلقات الجافة ويمتص الهواء ل~ 15 ثانية، أو حتى تجف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقبض الباب تغير موقف عينة إلى &quot;تحميل&quot;. وضع حل لفي 1 مل حقنة. المكونات حقنة في واحدة من الموانئ تحميل عينة. كرر حل B، ووضع في المقابل ميناء التحميل العينة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع من الزمن نقاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في القائمة الرئيسية، اكتب 1 لتشغيل إخماد التدفق. أدخل وقت رد الفعل (الصورة) ثم اضغط على &quot;دخول&quot;. سيتم عرض عدد حلقة رد فعل للاستخدام. التبديل إلى حاجة حلقة رد فعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل المقابض عينة إلى &quot;تحميل&quot;. يمزج رد فعل الحمل في الحلقات عينة حتى خارج المقصورة خلط المركزية. تحويل جميع المقابض إلى &quot;منطقة معلومات الطيرانE &quot;. تأكد من أن كافة المقابض هي في الموضع الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب 1.5 مل على نهاية الخروج الحلقة. اضغط على &quot;جو GO&quot; لتشغيل رد الفعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4. تحديث الحقن عازلة A و B حتى ضربوا السائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 2.2.6.2-2.2.6.3 لكل نقطة الوقت المطلوب. استثناء: لا تقم بتحميل محلول يحتوي على بداية كاشف (أي MgCl 2 في هذه الحالة) عندما تبريد سيطرة الصفر الوقت نقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من جمع العينات، أدخل &quot;ESC&quot; للعودة إلى القائمة الرئيسية. اضغط على &quot;7&quot; للعودة سائق عازلة حقنة لموقف وطنه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداة تنظيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المحاقن خليط التفاعل. تحويل عينة مقبض تحميل ل&quot;تحميل&quot; موقف. تحت فراغ، ويغسل كل حلقة العينة مع 10 مل من 0.2 هيدروكسيد الصوديوم N، تليها 10 مل 0.3 NH 3 ص 4 و 10 مل MeOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل المقابض حقنة ل&quot;تحميل&quot; موقف. اضغط لأسفل على كل SYR 3الغطاسون إنجي لاسترداد رد فعل وإخماد المخازن. غسل المحاقن مع 5 مل H 2 O مرتين على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الحقن مرة أخرى مع 5 مل H 2 O وتحويل المقابض إلى موقف &quot;النار&quot;. تغيير المواقف مقبض الباب وتشغيل فراغ لإزالة H 2 O. فلوش كما في الخطوة 2.2.4. إيقاف الصك. ويتم تحليل المنتجات كما هو موضح في الخطوات 1،7-1،12: ملاحظة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة T7 الحمض النووي بوليميريز والبروتينات النسخ الأخرى في خليط التفاعل لتحليل تأثيرها على التوليف التمهيدي أو التمديد. </li></ol></li></ol> 3. وحيد دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل ملاحظة: يتم إجراء أحادي دوران المقايسات التمهيدي تجميع / تمديد الخروج على نحو مماثل لردود فعل متعددة دوران، مع بعض الاختلافات الرئيسية: هذه المقايسات تتبع تحويل رديولبلد ATP إلى التمهيدي أو تمديد المنتجات، إلا أن تركيز ركائز والبروتينات هي consideraأعلى بلاي. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل تحقيق حل ميلي ثانية واحدة للسماح للتحليل رد فعل التوليف التمهيدي، لا بد من الاستفادة من آلة التدفق إخماد السريع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخاليط رد فعل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X، 3 ميكرومتر مسدوس GP4، 6 ميكرومتر ssDNA القالب، 0.6 ملي dNTPs، 1 ملم CTP، و 2 نانومتر [γ- 32 ف] اعبي التنس المحترفين. إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سريع لإخماد عملية تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفذ تفاعلات كما هو موضح في الخطوة 2.2. إذا رغبت في ذلك، إضافة البلمرة T7 الحمض النووي أو بروتين ملزمة T7 احد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي عند تركيز من 15 ميكرومتر و 20 ميكرومتر، على التوالي. في هذه الحالة، والمنتجات تمديد تتراكم في نظام الوقت الذي يسمح لأخذ العينات اليدوية للتفاعل. </li></ol></li></ol> تحليل 4. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب منحنيات تقدم المنتج لالأقل- غير الخطيةالساحات النماذج باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا قادرة على المربعات الصغرى نوبات و / أو التكامل العددي. فإن تفاصيل العملية تختلف مع البرنامج يعمل، ولكن أقل من أشكال معممة من المعادلات المستخدمة لتركيب البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد معدل تكوين المنتج من عدة تفاعلات التخليق دوران التمهيدي من المناسب للتقدم منحنيات لمعادلة خطية. إذا كان هناك انحناء كبير، استخدام طريقة معدل الأولي 13 و 14 عن طريق تركيب البيانات إلى وظيفة واحدة الأسي: ص = أ (ه - ك ر)، حيث ص هو تركيز المنتج، A هي السعة رد فعل، ك هو ثابت معدل لاحظ، ر حان الوقت، في ثوان. المنحدر من خط المماس في الوقت = 0 هو المعدل الأولي. ملاحظة: صالح قبل ثابتة تفاعلات التخليق التمهيدي الدولة لمعادلة خطية أو معادلة حالة ما قبل مستقرة انفجار ذ = A (ه - بو كRST ر) + معدل SS ر، حيث A هي السعة رد فعل، ك انفجار هو ثابت المعدل الملاحظ للانفجار حالة ما قبل ثابت، ومعدل ss غير أن حالة استقرار معدل SS = ك القط [أنزيم])، تي آن الأوان ، في ثوان. تناسب-دوران واحد تفاعلات التخليق التمهيدي منحنيات إلى وظيفة ذ = A واحد الأسي التقدم (ه - ك ر). في حالة GP4، تناسب البيانات عن طريق التكامل العددي 15، إلى نموذج مع ثلاث خطوات التكثيف NTP، حيث كل وسيطة هو في حالة توازن مع الانزيم، وذلك باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا. </li></ol>

<ol><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).</li>
<li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motors%2C+switches%2C+and+contacts+in+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li>
<li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li>
<li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li>
<li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li>
<li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li>
<li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li>
<li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li>
<li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li>
<li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658(2013).</li>
<li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+enzyme+kinetic+analysis%2C+1913%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li>
<li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).</li>
<li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

العامل الأكثر أهمية في أداء هذه التجارب هو توافر انزيم المنقى نشطة للغاية. خلال عملنا مع GP4، على سبيل المثال، وجدنا أن تخزين الإنزيم المنقى في المخزن (20 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم DTT) التي تحتوي على 50٪ الجلسرين في -20 درجة مئوية يؤدي إلى انخفاض في النشاط المحدد لإعداد أكثر من بضعة أشهر. لذلك نحن الآن فلاش تجميد قسامات صغيرة من GP4 النقي في 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم TCEP، و 1...

تكرار الحمض النووي هو ميزة الحفظ لجميع أشكال الحياة الخلوية. في حين هوية وعدد من مكونات النسخ المتماثل تختلف على نطاق واسع، ويشارك في الآليات العامة عبر تطور 1. هنا، نحن تصف والتجارب الحركية متقطعة القائم على هلام، وذلك باستخدام ركائز المشعة، التي تهدف إلى فهم حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا في المختبر عن طريق مكونات جسيم مكرر T7. آلية تكرار T7 عاثية بسيطة جدا، تتكون من البروتينات أربعة فقط (بوليميريز الحمض النووي، GP5، وعامل processivity لها، كولاي thioredoxin، وGP4-بريميز هيليكاز bifunctional، وبروتين DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل ملزم، GP2. 5) 2. هذه الميزة تجعل من نظام نموذجا جذابا لدراسة الآليات البيوكيميائية الحفظ تشارك في تكرار الحمض النووي. ويتم التركيز بشكل خاص على تشكيل الاشعال ريبونوكليوتيد التي كتبها T7 الحمض النووي بريميز، وهو حرجةخطوة لتر في الشروع في تركيب الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن ينظر أيضا في استخدام هذه البادئات من قبل البلمرة T7 الحمض النووي أو البروتينات النسخ الأخرى عن طريق إشراكها في خليط التفاعل. وT7 بريميز-هيليكاز، GP4، يحفز تشكيل الاشعال لتخليق الحمض النووي في تسلسل الحمض النووي محددة تسمى المواقع الاعتراف بريميز، أو استراتيجية الحد من الفقر، (5&#39;-GTC-3 &#39;). والسيتوزين في استراتيجية الحد من الفقر هو خفي، فمن الضروري للاعتراف الموقع، ولكن لا يتم نسخ ذلك في المنتج 3. الخطوة الأولى في التوليف التمهيدي من GP4 تتضمن تشكيل ثنائي النوكليوتيد pppAC، التي امتدت بعد ذلك لأرتب، وفي نهاية المطاف إلى الاشعال رباعي النوكليوتيد الوظيفية pppACCC، pppACCA، أو pppACAC تبعا لتسلسل في قالب 4. ويمكن بعد هذه الاشعال يتم استخدامها من قبل البلمرة T7 الحمض النووي للشروع في تركيب الحمض النووي، والذي هو أيضا عملية بمساعدة GP4 5، 6. في هذا الصدد، وبريميزنطاق استقرار tetraribonucleotides قصيرة للغاية مع القالب، ومنع التفكك، ويشارك البلمرة DNA بطريقة تؤدي إلى تأمين التمهيدي / القالب إلى موقع نشط 7 البلمرة. وتتكرر هذه الخطوات (RNA التوليف التمهيدي، عمليتي التحول التمهيدي لالبلمرة، والإرشاد) في دورات متعددة لتكرار حبلا متخلفة ويجب أن ينسق مع تكرار حبلا الرائدة. المقايسات الموصوفة هنا هي حساسة للغاية، ويمكن أداؤها في إطار زمني المعتدل. ومع ذلك، فهي نسبيا منخفضة الإنتاجية وعناية كبيرة يجب أن تمارس في الاستخدام والتخلص من المواد المشعة. اعتمادا على السرعة التي حصيلة التفاعل، يمكن للمرء أن يستخدم أداة لإخماد السريع لتحقيق العينات في فترات زمنية قابلة للتحليل مغزى من الدورات وقت رد الفعل إما في ثابت أو دولة ما قبل مستقرة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا المقايسات وصفها هنا لتقديم evidenc(ه) من أهمية إطلاق التمهيدي من المجال بريميز من GP4 في بدء شظايا أوكازاكي. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا دليلا على وجود دور تنظيمي لالحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل T7 البروتين، gp2.5 ملزمة، في تعزيز تشكيل التمهيدي كفاءة واستخدام 8.

<table><tbody><tr><td>بلورات تريس محددة مسبقا درجة الحموضة 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>قاعدة تريس</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-حمض الجلوتاميك ملح البوتاسيوم أحادي الهيدرات</td><td>SIGMA</td><td>G1501 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات</td><td>Mallinckrodt للكيماويات</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1،4-Dithiothreitol</td><td>J.T. بيكر</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات دوديسيل الصوديوم</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr> <tr><td>(Ethylenedinitrilo) حمض Tetraacetic ، ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي هيدرات</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr> <tr><td>[&alpha ؛ -32P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>مشعة ، واتخاذ تدابير وقائية</td></tr> <tr><td>[&gamma ؛ - 32 P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>مشع ، واتخاذ تدابير وقائية</td></tr><tr><td>100 mM dATP ، dCTP ، dGTP ، dTTP &nbsp ؛</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>أربعة dNTPs جزء من مجموعة</td></tr><tr><td>100 ملي مولار ATP و CTP</td><td>Epicenter</td><td>RN02825</td><td>جزء من مجموعة NTP</td></tr><tr><td>يبني ssDNA</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة</td><td>N / A</td><td>تسلسلات مخصصة &nbsp ؛</td></tr><tr><td>الميثانول&nbsp;</td><td>ماكرون فاين كيماويات</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>ثيرمو سيانتيفيك</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>بروموفينول أزرق</td><td>SIGMA</td><td>B8026 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>سيلين زيانول&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>أكريلاميد</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>سامة</td></tr> <tr><td>< م > N ، N & Prime ؛ < / م > - ميثيلين بيساكريلاميد</td><td>SIGMA</td><td>M7279 &nbsp ؛</td><td>سام</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>حمض البوريك</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>أداة إخماد التدفق السريع &nbsp;</td>شركة <td>Kintek</td><td>RQF-3&nbsp;</td><td></td></tr> شركة <tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>غير متاح</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&nbsp;</td><td>برنامج Synergy</td><td>غير متاح</td><td></td></tr></tbody></table>

حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا<em&gt; في المختبر</em&gt; من البروتينات النسخ المتماثل الجراثيم t7

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

نقدم هنا بروتوكولات للفحص الحركي لتخليق الحمض النووي المتأخر في المختبر بواسطة بروتينات النسخ المتماثل للعاثية T7. يعد T7 replisome أحد أبسط أنظمة النسخ المتماثل المعروفة ، ويتكون من أربعة بروتينات فقط ، وهي ميزة جذابة للتجارب الكيميائية الحيوية. يتم التركيز بشكل خاص على تخليق بادئات الريبونوكليوتيدات بواسطة T7 primase-helicase ، والتي يستخدمها بوليميراز الحمض النووي لبدء تخليق الحمض النووي. نظرا لأن آليات تكرار الحمض النووي محفوظة عبر التطور ، يجب أن تكون هذه البروتوكولات قابلة للتطبيق ، أو مفيدة كنقطة انطلاق مفاهيمية ، للمحققين الذين يستخدمون أنظمة نموذجية أخرى. البروتوكولات الموضحة هنا حساسة للغاية ويمكن للمحقق المتمرس إجراء هذه التجارب والحصول على بيانات لتحليلها في غضون يوم تقريبا. القطعة المتخصصة الوحيدة من المعدات المطلوبة هي أداة تدفق سريع التبريد ، ولكن هذه القطعة من المعدات شائعة نسبيا ومتاحة من مصادر تجارية مختلفة. ومع ذلك ، فإن العيوب الرئيسية لهذه المقايسات تشمل استخدام النشاط الإشعاعي والإنتاجية المنخفضة نسبيا.

وقد تم الحصول على النتائج الموضحة في الشكل 1A كما هو موضح في الخطوة 1 من البروتوكول، أي عن طريق أخذ عينات رد فعل التوليف التمهيدي يحفزه GP4 في ظل ظروف متعددة دوران يدويا. هنا، مجموعة واسعة من المنتجات بعد الكهربائي للهلام يمكن ملاحظتها باستخدام CTP المسمى مع 32 P في α موقف في تفاعلات التخليق التمهيدي (الشكل 1A). مقدمة المسمى، CTP، يظهر أعلى التنقل ويهاجر باتجاه الجزء السفلي من ه...

نصف المقايسات المتقطعة الحساسة القائمة على الهلام لفحص حركية بدء الخيوط المتأخرة باستخدام بروتينات النسخ المتماثل للعاثية T7.

حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا<em&gt; في المختبر</em&gt; من البروتينات النسخ المتماثل الجراثيم T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص حركية تصنيع الحمض النووي DNA للشريط البادئ والشريط المتأخر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تضاعف DNA، مثل كيفية تكوين البادئات بواسطة إنزيم DNA primase، وكيفية نقلها واستخدامها بواسطة إنزيم DNA polymerase. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بتحديد الخطوات الأساسية أثناء تصنيع قطع Okazaki.بما أن هذا الاختبار يستخدم مواد مشعة، يجب اتباع جميع اللوائح المؤسسية المتعلقة بالاستخدام الآمن للمواد المشعة والتخلص منها. ابدأ بتوزيع 2 µL من منظم صبغة الفورماميد في ثمانية أنابيب بولي بروبيلين سعة 1.5 mL، وهو ما يعادل عدد النقاط الزمنية المراد تحليلها. بعد ذلك، قم بتحضير خليط بحجم 20 µL يتكون من المنظم، وATP، وCTP، وCTP موسوم على مجموعة ألفا-فوسفات بواسطة P32، وقالب DNA أحادي السلسلة، وبروتين الجين 4، أو GP four primase helicase.قم بحضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد مرور خمس دقائق، استخدم الماصة لسحب 2 µL من الخليط، واخلطها مع 2 µL من منظم صبغة الفورماميد في أحد أنابيب 1.5 mL التي تم تحضيرها مسبقاً. يمثل هذا ضابط عدم التفاعل.أضف 2 µL من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 0.1 M إلى خليط التفاعل وابدأ تشغيل المؤقت فوراً. وبفواصل زمنية قدرها 10 ثوانٍ، اسحب يدوياً عينات بحجم 2 µL من خليط التفاعل، واخلطها مع صبغة الفورماميد في أنابيب سعة 1.5 mL. وبعد جمع جميع النقاط الزمنية، سخن العينات في كتلة تسخين عند 95 °C لمدة خمس دقائق.قم بتحميل أجزاء من العينات على هلام مخرّب للكهرباء (denaturing gel) لإجراء الفصل الكهربائي. ابدأ هذا الإجراء بتحضير خلائط التفاعل. حضّر 400 microliters من المحلول A الذي يحتوي على المنظم (buffer)، وGP four hexamer، وقالب DNA أحادي السلسلة، وdNTPs، وATP، وCTP، وCTP مُعلّم على مجموعة الفوسفات ألفا بواسطة P32.قم بتحضير 400 µL من المحلول B، والذي يحتوي على buffer بتركيز 1X و 20 mM من كلوريد المغنيسيوم. بعد ذلك، قم بتجهيز جهاز تدفق الإخماد السريع (rapid quench flow). قم بتشغيل الجهاز، وبمجرد ظهور القائمة الرئيسية، اكتب الرقم سبعة على لوحة مفاتيح الجهاز لتحريك محرك السرنجة إلى وضع السكون (home position).افتح موضع محقنة المنظم للتعبئة. املأ المحقنة C بمحلول الإخماد، ثم استخدم محقنة سعة 10 milliliter لملء خزانات منظم الجهاز A وB بالمنظم. تخلص من فقاعات الهواء عن طريق تحريك المكبس للداخل والخارج.قم بتغيير وضعية المقابض إلى وضعية الإطلاق. اكتب الرقم اثنين لضبط وضعية قضيب محرك المحقنة. اضغط على زر الضبط لأسفل لخفض المحقنة حتى يخرج المحلول المنظم من حلقة المخرج.اكتب escape للعودة إلى القائمة الرئيسية. لغسل الأنابيب، قم بتوصيل خط الخروج بمضخة تفريغ. قم بتغيير مقابض العينة إلى وضع الشطف (flush).اضبط المقابض في الوضع الأفقي لإغلاق حقنة المنظم. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية، واغمر حلقتي الشطف في الماء لمدة 10 ثوانٍ، ثم اغمرهما في الميثانول لمدة 10 ثوانٍ. جفف الحلقتين عن طريق سحب الهواء لمدة 15 ثانية تقريبًا، أو حتى تجفا.لتحميل العينات، قم بتغيير وضع مقبض العينات إلى وضع التحميل. ضع المحلول A في سرنجة سعة 1 mL، ثم قم بتوصيل السرنجة بأحد منافذ تحميل العينات، وبالمثل، ضع المحلول B في منفذ تحميل العينات المقابل. ابدأ في جمع النقاط الزمنية عن طريق كتابة الرقم واحد في القائمة الرئيسية لبدء تشغيل تدفق التبريد (quench flow).أدخل وقت التفاعل واضغط على مفتاح enter. سيظهر رقم حلقة التفاعل التي يجب استخدامها. انتقل إلى حلقة التفاعل المطلوبة.بعد غسل الأنبوب كما تم توضيحه سابقاً، قم بتدوير مقابض العينات إلى وضعية التحميل (load). قم بتحميل خلطات التفاعل في حلقات العينات حتى تصل إلى ما خارج حجرة الخلط المركزية مباشرة. قم بتدوير جميع المقابض إلى وضعية الإطلاق (fire)، وتأكد من أن جميع المقابض في الموضع الصحيح.ضع أنبوباً سعة 1.5 ملليلتر عند نهاية حلقة الخروج. اضغط على "go" لبدء التفاعل. بعد تكرار إجراء غسل الأنابيب، أعد تحميل محاقن المنظم A وB حتى تلامس مشغل محاقن المنظم.كرر خطوات إجراء التفاعل لكل نقطة زمنية مطلوبة، مع استثناء واحد، وهو عدم تحميل المحلول B عند إيقاف التفاعل لنقطة التحكم عند الزمن صفر. عند الانتهاء من جمع العينات، اضغط على مفتاح الهروب (escape) للعودة إلى القائمة الرئيسية. اضغط على الرقم سبعة لإعادة محرك حقنة المنظم إلى موضع الأصل.ابدأ بتنظيف الجهاز عن طريق إزالة محاقن خليط التفاعل، وأدر مقبض تحميل العينة إلى وضع التحميل. تحت vacuum، اغسل كل حلقة عينة بـ 10 milliliters من هيدروكسيد الصوديوم، وحمض الفوسفوريك، والميثانول على التوالي. اضغط على مكابس المحاقن الثلاثة لاسترجاع محاليل التفاعل ومحاليل الإخماد.اغسل المحاقن بخمسة مللي لتر من الماء مرتين على الأقل. املأ المحاقن مرة أخرى بخمسة مللي لتر من الماء، وأدر المقابض إلى وضع الإطلاق (fire position)، ثم قم بتشغيل جهاز التفريغ وقم بتنزيل المشغل عبر أمر لوحة المفاتيح لإزالة الماء. اغسل الأنابيب كما تم توضيحه سابقاً.وأخيراً، قم بإيقاف تشغيل جهاز التدفق للتبريد السريع. يتم بعد ذلك تحليل العينات كما هو موضح في البروتوكول النصي. تم الحصول على هذه النتائج من خلال أخذ عينات يدوياً من تفاعل تخليق بادئ تم تحفيزه بواسطة GP four تحت ظروف دورات متعددة.يُظهر السلف المُوسوم CTP أعلى درجة من الحركية ويهاجر نحو أسفل الهلام، تليه الأنواع التي تهاجر ببطء أكثر، والتي تقابل الصبغة وتترا-ريبونوكليوتيدات التي تم تخليقها بواسطة GP four. واعتماداً على مدة الحضن وسياق تسلسل القالب، يمكن ملاحظة نواتج مُوسومة إضافية تقابل أوليغومرات أعلى. وعند استخدام جهاز إخماد سريع لفحص التفاعل الذي يحفزه GP four في أطر زمنية تتراوح من الثواني وصولاً إلى بضع مللي ثانية (ms)، يتضح أن تراكم البادئ ليس خطياً، بل يظهر ملفاً ثنائي الطور يشار إليه بالخط المتصل.يشير هذا إلى أن تكوين المنتج يتم بسرعة، وأن عملية التحرير هي التي تحدد معدل التفاعل في الحالة المستقرة. ويمثل الخط المنقط منحنى تقدم افتراضي كان سينتج لو لم يصاحب تكوين البادئ بواسطة GP four انفجار في حالة ما قبل الاستقرار. وتوفر تجربة تخليق البادئ بدورة واحدة معلومات حول تكوين وتحلل الأنواع الوسيطة أثناء تحويل الركيزة إلى منتج.توضح صورة الهلام المسار الزمني لتكوين الرباعيات (tetramer). ويوضح الرسم البياني تكوين المركبات الوسيطة مقابل الوقت. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون 90 دقيقة إذا نُفذت بشكل صحيح.لا تنسَ أن العمل باستخدام الكواشف المشعة يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل التدرع المناسب، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

يوضح هذا البروتوكول بسيطة المجهري مضان المفرد جزيء تقنية لتصور تكرار الحمض النووي التي replisomes الفردية في الوقت الحقيقي.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

نحن تصف طريقة لمراقبة حقيقية تكرار وقت جزيئات الحمض النووي الفردية بوساطة بروتينات للنظام عاثية تكرارها.

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

مصير replisome عقب اصطدامها وجها لوجه بوليميريز الحمض النووي الريبي (RNAP) غير معروف. نجد أن الأكشاك replisome عند اصطدامها RNAP وجها لوجه ، ولكن بعد استئناف استطالة تهجير RNAP من الحمض النووي. MFD يعزز إعادة تشغيل النسخ المتماثل من خلال تسهيل تهجير RNAP بعد الاصطدام.

إعادة تشغيل مباشرة من شوكة المتماثل المتوقفة من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي هيد اون

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

قد تم تصميم جيل جديد من المنصات ترجمة النسخ خالية من الخلية لبناء النظم البيوكيميائية في المختبر من خلال تنفيذ الدوائر الجينات. في هذه المقالة، يصف لنا كيف bacteriophages، مثل MS2 و ΦΧ174 و T7، يتم توليفها من الجينوم استخدام نظام تكستل كولاي كل خلية خالية.

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

ويرد وصف استنساخه، ودقيقة، والوقت كمي PCR (qPCR) طريقة فعالة لتعداد عاثية T7 هنا. البروتوكول يصف بوضوح بالعاثية المجينية الحمض النووي إعداد وإعداد رد فعل بكر وظروف ركوب قبكر وتحليل البيانات قبكر.

PCR الكمي من عاثية T7 من بيوبانينج

في هذه المخطوطة ، نصف بروتوكولا لفحص النسخ وظيفيا والنشاط المثبط للعوامل المضادة للبكتيريا التي تستهدف النسخ البكتيري.

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

تكمن تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي في صميم العديد من العمليات الخلوية. هنا ، نصف طريقة في الجسم الحي لعزل الحمض النووي الريبي المحدد وتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة به. هذا يمكن أن يلقي ضوءا جديدا على كيفية تنظيم الحمض النووي الريبي في الخلية.

رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

ذبابة الفاكهة لا يزال يكون مفيدا بشكل استثنائي في دراسة تكاثر الميتوكوندريا والوراثة. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا يستخدم لتسمية الحمض النووي الميتوكوندريا المتماثل (mtDNA) في ذبابة الفاكهة المبايض البالغة باستخدام 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، مما يسهل الكشف عن الآليات المرتبطة بوراثة الميتوكوندريا التي كانت قابلة للنقاش سابقا.

في الموقع وصفها من الحمض النووي النسخ المتماثل في ذبابة الفاكهة الكبار المبايض عن طريق ايدو تلطيخ

نصف هنا نهجا سريعا وبسيطا نسبيا لرسم خرائط توقيت تكاثر الثدييات على مستوى الجينوم ، من عزل الخلية إلى التحليل الأساسي لنتائج التسلسل. سيتم توفير خريطة جينومية لبرنامج النسخ المتماثل التمثيلي باتباع البروتوكول.

تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

اكتشف حركيات تخليق الحمض النووي المتخلفة الحبلا باستخدام بروتينات النسخ المتماثل للجرثومة T7. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة تكوين البرايمرات ونقلها إلى بوليميراز DNA بدقة عالية.

حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا

استكشف المزيد من الفيديوهات