توليف حيويا الكريستال السائل المرنة كسوات كما السقالات الخليوي لزراعات الخلايا 3D المكانية

الهدف من هذا الإجراء هو إعداد سقالات خلوية قابلة للتحلل وثلاثية الأبعاد تشبه الرغوة تعتمد على اللدائن البلورية السائلة ذات السلسلة الجانبية المتوافقة حيويا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات البلورات السائلة والطبية الحيوية ، مثل تأثيرات خصائص المطاط الصناعي البلوري السائل على تكاثر الخلايا ومحاذاتها. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة لسقالات الخلية ثنائية الأبعاد هي أنها تسمح بدراسة التفاعلات المكانية بين الخلية والخلية والتي نادرا ما تكون ممكنة في البيئات الكلية ثنائية الأبعاد.

بشكل عام ، سيكافح الجدد في هذه الطريقة مع اختبارات الضغط اللمسي. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد أن اضطررنا إلى تغيير الوسائط في مئات أطباق بتري. تساءلنا عما إذا كانت اللدائن البلورية السائلة يمكن أن تدعم خلايا العضلات على شبكة ثلاثية الأبعاد ، للقضاء على استخدام العديد من أطباق بتري.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث تتطلب بعض الخطوات معالجة دقيقة للمواد الكيميائية. علاوة على ذلك ، قد يكون تشكيل قالب الرغوة المعدنية أمرا صعبا. أولا ، املأ أمبولة سعة 20 مليلتر بمحلول 2٪ من حيث الحجم من PFOTES في التولوين.

حرك المحلول في الأمبولة لمدة 24 ساعة لصبغة الأمبولة من الداخل. اشطف الأمبولة السيلانية بكحول الأيزوبروبيل وجففها على حرارة 140 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ضع 3.64 جرام من إبسيلون-كابرولاكتون المقطر ، و 0.5 جرام من ألفا كلورو إبسيلون كابرولاكتون ، و 0.25 مل من الجلسرين في الأمبولة الجافة.

دوامة الخليط لمدة دقيقة واحدة. ثم أضف 4.90 جرام من DL-lactide إلى الخليط ، وقم بتطهير جو الأمبولة بغاز النيتروجين لمدة دقيقة واحدة. غطي فتحة الأمبولة بورق الألمنيوم ، وسخني الخليط على حرارة 120 درجة مئوية لمدة ساعتين تقريبا لإذابة DL-lactide.

قم بتدوير الخليط لتعطيل أي مواد صلبة غير مذابة ، ثم أضف 66 ميكرولترا من 10-2-إيثيل هيكسانوات إلى الأمبولة ، والدوامة مرة أخرى. أغلق الأمبولة بورق الألمنيوم وسخني الخليط على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإعادة إذابة DL-lactide. بمجرد ذوبان DL-lactide مرة أخرى ، قم بدوامة الخليط بقوة ، وتطهير جو الأمبولة بغاز النيتروجين.

ختم الأمبولة بحاجز مطاطي. أدخل إبرة متصلة بخط فراغ من خلال الحاجز ، وابدأ الفراغ. قم بإغلاق عنق الأمبولة باللهب ، مع الحرص على عدم إذابة السدادة المطاطية.

بمجرد إغلاق العنق ، سخني خليط التفاعل على حرارة 140 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ثم اترك الخليط يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. افتح الأمبولة وقم بإذابة خليط التفاعل اللزج في 10 مل من ثنائي كلورو ميثان.

انقل الخليط إلى قمع منفصل. ضع قارورة تحتوي على 100 مل من الميثانول في حمام ثلج جاف وأسيتون لتبريد الميثانول إلى 78 درجة مئوية تحت الصفر. بمجرد أن يبرد الميثانول ، قم بتأمين القمع الفاصل فوق القارورة.

أضف خليط التفاعل إلى الميثانول البارد بمعدل قطرتين كل ثانية. اجمع الراسب الأبيض الناتج على ورق التصفية. جفف الراسب في فرن مفرغ من الهواء بين 50 و 60 درجة مئوية للحصول على منتج ألفا كلورو SBC ثلاثي الأذرع.

لتحضير ألفا كوليستريل ثلاثي الأذرع SBC ، يتم استبدال ذرة الكلور المعلقة بأزيد. ينتج عن تفاعل النقر مع الكوليستريل 5-هيكسينوات قلادة كوليستریل كجزء من البلورة السائلة. لبدء تحضير سقالة المطاط الصناعي البلوري السائل ، امزج 0.75 جرام من ألفا كوليستيريل ثلاثي الأذرع SBC مع 0.25 مل من HDI و 0.24 مل من إبسيلون كابرولاكتون المقطر.

أضف إلى هذا 60 ميكرولتر من 10-2-إيثيل هيكسانوات ودوامة الخليط. ثم قم بقطع قطعة سنتيمترا واحدا في أربعة سنتيمترات من رغوة معدن النيكل. قم بلف رغوة النيكل في أسطوانة قطرها سنتيمترا واحدا وطولها سنتيمترا واحدا لتشكيل قالب لسقالة رغوة المطاط الصناعي الكريستالية السائلة.

ضع القالب في قارورة زجاجية أو حاوية رقائق الألومنيوم ، واسكب خليط المطاط الصناعي البلوري السائل فوق القالب حتى يتم تغطيته بالكامل. اترك القالب يجلس في خليط المطاط الصناعي البلوري السائل لمدة دقيقتين ، ثم قم بإزالة الفائض باستخدام ماصة. سخني الخليط والقالب على حرارة 80 درجة مئوية طوال الليل.

ثم انزع ورق الألمنيوم أو اكسر الزجاج. استخدم شفرة حلاقة لإزالة المطاط الصناعي البلوري السائل الزائد لفضح قالب معدن النيكل. ضع الرغوة في قارورة وأضف 70 مل من محلول مائي مشبع من الحديد ثلاثة كلوريد.

قلب الرغوة في المحلول لمدة ثلاثة أيام في درجة حرارة الغرفة لإذابة قالب النيكل. كل 24 ساعة ، حرك الرغوة في ماء منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة ، ثم استأنف التقليب في محلول ثلاثة كلوريد من الحديد الطازج. بعد اليوم الثاني من التحريك ، قم بإجراء اختبار ضغط اللمس على رغوة المطاط الصناعي البلوري السائل.

تشير مقاومة الضغط اللمسي إلى أن قالب النيكل لا يزال موجودا في الرغوة. بعد اليوم الثالث ، تم التخلص من كل قوالب النيكل ، وتبدو الرغوة الناتجة ناعمة جدا وسهلة الضغط بالكامل. يجب التخلص من قالب النيكل تماما.

من المهم شطف رغوة المطاط الصناعي الكريستالية السائلة جيدا في كلوريد الحديد حتى تصبح ناعمة الملمس عند إجراء اختبار الضغط باللمس. سقالة رغوة المطاط الصناعي الكريستالية السائلة جاهزة الآن للتمييز والاستخدام. بمجرد أن تصبح رغوة المطاط الصناعي الكريستالية السائلة ناعمة ، اشطفها بنسبة 70٪ من الإيثانول لتعقيمها.

لبدء عملية البذر ، اغسل مرة أخرى سقالات رغوة المطاط الصناعي السائل مرتين في مليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول لتعقيم أسطح المطاط الصناعي. ثم قم بإشعاع السقالات بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق. اغسل السقالات بجزء آخر من المليلتر من 70٪ من الإيثانول.

اشطف السقالات بملليلتر واحد لكل من الماء المعقم والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات. قم بتحميل سقالات المطاط الصناعي الكريستالية السائلة المعقمة في ألواح استزراع 24 بئرا. قم بإعداد وعد تعليق الخلايا ذات الأهمية في وسط نمو الخلايا المناسب مع البنسلين والستربتومايسين.

خفف معلق الخلية إلى 1.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 100 ميكرولتر باستخدام وسط النمو. قم بإيداع قطرة من معلق الخلية المخفف فوق كل سقالة مطاطية من الكريستال السائل. احتضان سقالات المطاط الصناعي الكريستالية السائلة المصنفة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة ساعتين.

أضف 0.5 مل أخرى من وسط النمو إلى كل سقالة ، واستمر في الحضانة. كل 48 ساعة ، اغسل السقالات المصنفة بمليلتر واحد من PBS ، وأضف وسط نمو جديد. استمر في احتضان السقالات حتى تصبح الخلايا جاهزة للفحص المجهري.

تتيح LCs المعقدة دراسة تركيبات الأنسجة المعقدة مع تعزيز نمو الخلايا وتكاثرها. من أجل الحفاظ على صلاحية الخلية ، يجب تعقيم الرغوة والحفاظ على نظافة الثقافات في جميع الأوقات. للتحضير للفحص المجهري ، قم بتثبيت الخلايا على السقالات بمحلول 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 15 دقيقة.

انقع العينات ثلاث مرات في ثلاثة ملليلتر من PBS لمدة خمس دقائق. ضع عينة سقالة واحدة في أنبوب Eppendorf. تلطخ العينة بمحلول 0.1٪ DAPI في 500 ميكرولتر من PBS لمدة 10 دقائق.

انقع العينة مرتين في مليلتر واحد من PBS لمدة خمس دقائق. وبعد ذلك ، قم بتصوير العينة على الفور باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. احصل على مكدسات الصور التي تمتد عبر العينة وقم بتحليل البيانات في برنامج معالجة الصور.

تم صب SBC ثلاثي الأذرع مع شقوق من الكريستال السائل على قالب رغوة النيكل مع HDI كرابط متقاطع. تمت إزالة قالب النيكل عن طريق النقش للحصول على رغوة المطاط الصناعي الكريستالية السائلة. تم إجراء اختبار تشوه الضغط بشكل دوري لمراقبة عملية النقش.

بمجرد إذابة النيكل تماما ، أظهر اختبار تشوه الضغط انخفاضا بنسبة 70٪ في الحجم عند ضغطه. عند تحرير الضغط ، استعادت رغوة المطاط الصناعي الكريستالية السائلة باستمرار حجمها وشكلها الأصلي. يعزى هذا السلوك إلى شقوق البلورات السائلة ، حيث أن رغاوي المطاط الصناعي المماثلة التي تفتقر إلى جزء الكوليسترول إبسيلون-كابرولاكتون لم تتعافى من الضغط.

أظهر SCM لتشكل الرغوة الداخلية شبكة مترابطة من دعامات الرغوة المجوفة. يعزى التشكل المنتظم إلى بنية رغوة النيكل ، مما يشير إلى أنه يمكن التحكم في حجم المسام والشكل العام عن طريق اختيار قالب معدني مناسب. تم زرع الرغوة بخلايا الورم الأرومي العصبي ، والتي تم ربطها بجدران الشبكة في غضون يومين.

بعد 30 يوما من البذر ، كشف الفحص المجهري متحد البؤر أن الخلايا امتدت فوق شبكة المطاط الصناعي البلوري السائل ، وشكلت طبقات متعددة منتشرة في جميع أنحاء رغوة المطاط الصناعي. لوحظ استطالة نوى الخلية ، وكان مرتبطا بمحاذاة الخلية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاثة إلى أربعة أسابيع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وإعداد سقالات الخلايا المطاطية البلورية السائلة بأحجام وأشكال مسام محددة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم توصيف كل منتج بشكل كامل ومراقبة صلاحية الخلية وتوسعها. علاوة على ذلك ، تعد تقنية التلوين المناسبة مهمة للحصول على صور مجهرية متحد البؤر بسهولة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا أن تتعرض اللدائن البلورية السائلة لمحفزات خارجية ، مثل الإجهاد ، أو المجالات المغناطيسية والكهربائية ، للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية تأثير الترتيب الجزيئي متباين الخواص لللدائن البلورية السائلة على استجابة الخلية. تنطبق الآثار المترتبة على هذه التقنية على دراسة عمليات المرض ، لأنها توفر منصة لدراسة تأثيرات العوامل الخارجية ديناميكيا على نشاط المرض المحاكي ، وعمليات الإصلاح اللاحقة. على الرغم من أن رغوة المطاط الصناعي البلورية السائلة smectic يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتفاعلات الخلية الخلية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا مع مواد أخرى ، مثل أشباه الموصلات أو الهياكل النانوية المعدنية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات الطب الحيوي لتصميم منصات تجريبية طويلة الأجل تعكس الأنظمة المعيشية.