في إعداد الوجه من ماوس سفن الدم

ويرد وصف لإجراء صنع الاستعدادات وجهه من الشريان السباتي الماوس والشريان الأبهر. هذه الاستعدادات، عندما ملطخة إمونوفلورزنتلي مع الأجسام المضادة محددة، تمكننا من دراسة توطين البروتينات وتحديد أنواع الخلايا داخل جدار الأوعية الدموية بأكمله من قبل المجهر متحد البؤر.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير الشريان الأورطي والشريان السباتي للتلطيخ المناعي للوجه بعد ربط الشريان السباتي الأيسر. تسمح لنا هذه الطريقة بدراسة التنظيم ، وكل تعبير بروتين ، والحالة المحتملة للخلايا التاجرية وخلايا الأوعية الدموية الأخرى في طرق البقع المناعية. تسمح مستحضرات الوجه بتحليل مناطق كبيرة عبر الأوعية الدموية لتقييم الاختلاف الإقليمي في التعبير عن مختلف معلمات الخلايا الطبيعية والمحتملة.

سيظهر الإجراء الدكتور Quaico ، الجراح الدقيق في مجموعتنا. ابدأ بوضع الفأر المخدر على لوح جراحي في وضع الاستلقاء. بعد التأكد من عدم الاستجابة لشريط قرصة إصبع القدم ، قم بتثبيت الكفوف الأمامية على اللوحة في وضع التمدد الخارجي وكلا الساقين الخلفيتين على الجانب الأيمن من الماوس لعرضها على الجانب الأيسر من الرقبة.

إزالة الشعر حول منطقة عنق الرحم وتطهير الجلد المكشوف. قم بتغطية الفأر بستارة جراحية معقمة مع ثقب فوق المنطقة الجراحية ووضع مرهم على عيون. حرك الفأر تحت مجهر التشريح ، وقم بعمل شق بطني في منتصف الخط حول منطقة عنق الرحم.

أعد وضع الغدد اللعابية التي تغطي الأوعية الدموية إلى الجانب الأيسر من لكشف الشريان السباتي المشترك الأيسر ، والذي يتشعب إلى الشريان السباتي الداخلي الأيسر والشريان السباتي الخارجي الأيسر. قم بإزالة النسيج الضام برفق حول وأسفل الشريان السباتي الداخلي الأيسر واستخدم ملقطا لتمرير خياطة حريرية بطول 2.5 سم من خياطة الحرير الستة قطع مسبقا تحت الشريان ، باستخدام ملقط ثان لسحب الخيط ما يقرب من ثلث طوله إلى الجانب الآخر من الوعاء. ربط الشريان السباتي الداخلي الأيسر.

ثم قم بإزالة النسيج الضام حول الشريان السباتي الخارجي الأيسر كما هو موضح للتو ، وقم بعمل ربط قريب من الشريان الغرقي العلوي الأيسر. عندما يتم ربط جميع الشرايين باستثناء الشريان القذالي ، أعد الغدد اللعابية إلى مواقعها الأصلية وترطيب المجال الجراحي بقطرتين إلى ثلاث قطرات من المحلول الملحي. ثم استخدم ست خيوط فيكريل مطلية ب O لإغلاق الجلد ووضع الفأر في القفص الدافئ مسبقا مع المراقبة حتى الاستلقاء الكامل.

عند انتهاء التجربة ، قم بتأمين الفأر في وضع ضعيف على لوح تشريح واستخدم مقص القزحية لفضح تجويف البطن بشق منتصف الخط. قطع الأضلاع بشكل جانبي إلى القص لفضح التجويف الصدري. ثم قم بتقطيع الشريان الفخذي وأدخل إبرة قياس 26 متصلة بوفرة الجاذبية مثبتة في قمة البطين الأيسر لغزارة الدورة الدموية بمحلول ملحي مكمل بالهيبارين.

استمر في الوفرة حتى يصبح المحلول الملحي المتدفق من الجرح واضحا. ثم قم بتبديل نظام الوفرة من محلول ملحي إلى 4٪ بارافورمالدهيد في PBS. بعد خمس دقائق ، حرك الفأر تحت مجهر التشريح واستخدم مقصا غير حاد وملقطا لحصاد الشريان الأورطي والشرايين السباتية اليمنى واليسرى.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري من PBS وقم بإزالة الدهون والأنسجة الضامة بعناية ، متبوعا بالفصل والانقسام الطولي للشريان الأورطي والشرايين السباتية لفضح البطانة. أهم شيء يجب تذكره عند إجراء مستحضرات الأوعية الدموية هو أن الخلايا البطانية تتلف بسهولة بسبب المناولة الخشنة. لا تمد الأوعية في أي وقت ، خاصة أثناء خطوات الحصاد والتنظيف.

ثم انقل كل وعاء إلى آبار فردية من صفيحة 12 بئر تحتوي على 0.5 مل من محلول النفاذية لكل بئر. تخلل الأوعية الدموية لمدة 10 دقائق مع التأرجح في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بغسل قصير في PBS. منع أي ارتباط غير محدد بحضانة لمدة 30 دقيقة في مصل طبيعي بنسبة 10٪ من نفس النوع مثل الأجسام المضادة الثانوية المخطط لها في TTBS ، مع التأرجح في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتسمية العينات بالأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية المخففة في TTBS مع مصل طبيعي بنسبة 10٪ بين عشية وضحاها مع هزاز عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، اشطف الأوعية الدموية بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في TTBS مع التأرجح في درجة حرارة الغرفة ، تليها الحضانة في الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخففة في TTBS و 10٪ مصل طبيعي ودابي. أعد العينات إلى الروك وتغطيتها للحماية من الضوء.

بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الهزاز ، اغسل العينات ثلاث مرات في TTBS طازج كما هو موضح ، متبوعا بشطف قصير في PBS ، وضع قطرة واحدة من الكاشف المضاد للبهتان لكل وعاء على أكواب غطاء فردية مقاس 22 × 50 ملم. تحت المجهر ، ضع وعاءا واحدا في كل قطرة من الكاشف بحيث تكون البطانة متجهة لأسفل ، وقم بتغطية الأوعية بزجاج منزلق واحد مقاس 22 × 75 ملم لكل عينة. ضع الشرائح على منديل مختبري نظيف وقم بتغطيتها بقطعتين من مناديل المختبر و 3.5 كيلوغرام من الوزن لتسطيح الأوعية.

بعد خمس دقائق كحد أقصى ، قم بإزالة الوزن ، وامسح المحلول الزائد من حول زلات الغطاء. ثم ضعي طلاء الأظافر على الزوايا الأربع لزلات الغطاء وضعي الشرائح في صندوق منزلق ، وغطي جانب الانزلاق لأعلى. في صباح اليوم التالي ، استخدمي المزيد من طلاء الأظافر لإغلاق زلات الغطاء تماما وتصوير الأوعية بمجرد جفاف طلاء الأظافر.

هنا تظهر صورة نموذجية للزهور المناعي للوجه البطاني المزدوج الملطخ بجزيء التصاق الخلايا المضادة للفيرويف والجزيء المضاد للخلايا الوعائية بأجسام مضادة واحدة وتوضح قسما بصريا واحدا من الشريان الأورطي الفأري الذي تم التقاطه بالقرب من فتحة الشريان الوربي. لاحظ تلطيخ المخطط الخطي الأخضر عند تقاطع التصاق الخلايا البطانية وجزيء التصاق الخلايا الوعائية القوي المضاد لتلطيخ واحد عند فتحة الشريان الوربي حيث من المعروف أن تدفق الدم المضطرب يحدث. في هذه الصور ، يمكن ملاحظة تلطيخ الوجه en للشريان السباتي الأيسر المرتبط جزئيا والشريان الأيمن غير المرتبط بعد يوم واحد من الجراحة ، مع زيادة جزيء التصاق الخلايا المضادة للأوعية الدموية ، تلطيخ واحد واضح في الوعاء المربوط.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء ربط جزئي للشريان السباتي الأيسر وإجراء مستحضرات في الأوعية الدموية للفأر. خذ هذا مع بصرك للحيوانات الصغيرة الأخرى. يقتصر استخدام مستحضرات en face الآن على تلطيخ الإزهار المناعي ، ولكن يمكن استخدامه أيضا مع طرق أخرى ، مثل دراسة تلك المناطق بأكملها بعد تلطيخ الأوريول ، أو للتجارب المضادة خارج الجسم الحي.