الأمثل والتحليل المقارن لطرق التخصيب الحمض النووي النباتي أورغانيلار مناسبة للجيل القادم التسلسل

الهدف العام من هذه التجربة هو مقارنة طريقتين تستخدمان لعزل الحمض النووي العضوي عالي الجودة ، كل من الحمض النووي البلاستيد والميتوكوندريا من أنسجة أوراق النبات المناسبة لتسلسل الجيل التالي. يمكن أن تساعد هذه الأساليب في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا النبات مثل مدى تنوع العضيات عبر الأصناف وكيف تؤثر التغييرات في تسلسل الجينوم العضوي أو الهيكل على التطور والاستجابة للإجهاد. سنقارن تقنيتين ، طريقة الطرد المركزي التفاضلي التي تثري نوعا معينا من العضيات وتقنية التجزئة الفوقية التي تستعيد الحمض النووي العضوي الكلي من عينات الأنسجة المجمدة الأصغر.

الإجراء القياسي لزراعة شتلات القمح ، هو زرع البذور في الفيرميكوليت ، في أواني مربعة بها أربع إلى ست بذور في كل زاوية. انقل الأواني إلى دفيئة بدورة إضاءة مدتها 16 ساعة. سقي النباتات كل يوم.

قم بتسميد النباتات بربع ملعقة صغيرة من سماد حبيبي 20-20-20 MPK عند الإنبات ، ومرة أخرى بعد سبعة أيام من الإنبات. لتملق شتلات القمح وبذور النبات والعناية بالنباتات كما هو الحال في الإجراء القياسي. لكن ضع الأواني في غرفة نمو مظلمة.

بديل لزراعة هذه الشتلات في غرفة نمو مظلمة هو تغطية النباتات في الدفيئة ولكن بالتهوية المناسبة. الخطوة الأولى في هذا الإجراء هي عزل العضيات. احصد خمسة جرامات من الأنسجة الطازجة واشطفها بالماء البارد والمعقم في دورق مبرد على الثلج.

باستخدام المقص ، قم بتقطيع أنسجة الأوراق إلى قطع بحجم سنتيمتر واحد تقريبا مباشرة في أنبوب 50 ملم مبرد مسبقا يحتوي على أسطوانتين لطحن السيراميك. احتفظ بالعينات على الجليد طوال العملية. لتجنب التلوث المتبادل ، من المهم تغيير المقص بين العينات.

خذ العينات إلى غطاء الدخان وأضف 20 مل من المخزن المؤقت STE إلى كل أنبوب سعة 50 مل. ضع العينات في كتل طحن مبردة مسبقا في جهاز طحن الأنسجة وطحن العينات لمدة 30 ثانية بمعدل 1،750 دورة في الدقيقة. ضع العينات على الجليد لمدة دقيقة تقريبا.

قم بتدوير مواضع العينة وطحنها لمدة 30 ثانية أخرى بمعدل 1,750 دورة في الدقيقة. أعد العينات إلى دلو الثلج. لكل عينة ، أدخل قمعا في أنبوب نظيف سعة 50 مليلتر يوضع في الثلج وضع طبقة واحدة من قماش الترشيح في القمع.

قم ببلل قطعة قماش الترشيح مسبقا بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت STE وحفظ التدفق من خلاله. صب الأنسجة المتجانسة في القمع. اشطف أنبوب الطحن ب 15 مل من المخزن المؤقت STE ، وقم بتلخيص الأنبوب وقلبه لشطف الجدران والغطاء وصب محتوياته في القمع.

قم بإزالة أحجار السيراميك بعناية ثم اضغط على قطعة قماش الترشيح واعصرها في القمع. لتجنب التلوث المتبادل ، قم بتغيير القفازات بين العينات. لف أغطية الأنبوب بغشاء البارافين لتجنب الانسكاب.

جهاز طرد مركزي عند 2 ، 000 × جم ، عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، استخدم ماصة مصلية لشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات ووضعها في أنبوب طرد مركزي عالي السرعة سعة 50 مليلتر مع حشية مانعة للتسرب محكمة. ضع كوبا صغيرا من الثلج على ميزان ، وقم بتمزيق الميزان ووزن كل مادة طافية.

استخدم المخزن المؤقت STE لموازنة الأنابيب في حدود 0.1 جرام ثم جهاز الطرد المركزي عند 18,000 × جم في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. عند اكتمال الطرد المركزي ، أعد العينات إلى غطاء الدخان وتخلص من المادة الطافية. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ST إلى الحبيبات وأعد تعليقه برفق باستخدام فرشاة رسم ناعمة.

أضف 24 مل من المخزن المؤقت ST للحصول على حجم نهائي يبلغ 25 ملليلترا. قم بتدوير فرشاة الرسم برفق في تعليق لخلطها ، ثم اضغط على فرشاة الرسم على جانب الأنبوب لإزالة كل السوائل قبل إزالة فرشاة الرسم. بعد موازنة الأنابيب ، جهاز الطرد المركزي عند 18،000 × جم في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

أثناء هذا الطرد المركزي ، قم بإعداد محلول الحمض النووي 1 كما هو موضح في بروتوكول النص وقم بنقل 200 ميكرولتر إلى أنبوب 1.5 مليلتر لكل عينة. عند اكتمال الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وصمة عار الأنبوب. إلى كل أنبوب طرد مركزي عالي السرعة ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت STE وأعد تعليق الحبيبات باستخدام فرشاة طلاء ناعمة.

ضع فرشاة الطلاء في أنبوب 1.5 مليلتر المعد مسبقا والذي يحتوي على 200 ميكرولتر من محلول الحمض النووي 1 وقم بتدوير فرشاة الطلاء لإزالة أي حبيبات متبقية عالقة في الفرشاة. ماصة محلول الحمض النووي 1 في أنبوب الطرد المركزي عالي السرعة وقم بالتدوير برفق للخلط. لف فيلم البارافين حول الجزء العلوي من كل أنبوب واحتضنه عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة.

أثناء الحضانة ، اخلطي برفق عن طريق الدوران. باستخدام طرف ماصة بفتحة عريضة ، قم بإخراج خليط الحبيبات برفق من الأنبوب وضعه في أنبوب ربط منخفض سعة 1.5 مل. أضف 500 ميكرولتر من 400 ملليمولار EDTA ، درجة الحموضة 8.0 إلى أنبوب الطرد المركزي عالي السرعة.

قم بإزالة الحبيبات المتبقية تماما ونقل EDTA إلى أنبوب الربط المنخفض الذي يحتوي على خليط الحبيبات. تخلط بلطف عن طريق الانعكاس. جهاز طرد مركزي عند 18،000 × جم ، عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية ، وصمة عار كل أنبوب واستخدم الحبيبات على الفور لعزل الحمض النووي. في هذه الطريقة ، يتم إثراء الحمض النووي العضوي من الحمض النووي الجيني الكلي الذي تم استخراجه باستخدام أعمدة استخراج الحمض النووي التجارية. قم بإعداد الكمية المطلوبة من الخرز المغناطيسي المرتبط بالبروتين MBD2 FC ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بقياس التفاعلات لاستخدامها بين ميكروغرام وميكروغرام من إجمالي الحمض النووي المدخل.

في هذا العرض التوضيحي ، مطلوب 160 ميكرولترا من الخرز لميكروغرام واحد من إجمالي الحمض النووي المدخل. لالتقاط الحمض النووي الميثيلي، أضف ميكروغراما واحدا من الحمض النووي المدخل إلى أنبوب يحتوي على 160 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المرتبط ب MBD2 لكل عينة فردية وقم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل بطرف تجويف عريض. أضف الحجم المناسب من المخزن المؤقت للغسيل 5x للحصول على تركيز نهائي قدره 1x وقم بعمل العينة لأعلى ولأسفل بطرف تجويف عريض، عدة مرات للخلط.

قم بتدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لنجاح السحب ، من الأهمية بمكان خلط الخرزات جيدا أثناء الحضانة ، خاصة إذا كان هناك تكتل كبير للحبة. لمنع تكتل الخرزة ولضمان سحب الحمض النووي الميثيلي، قم بماصة العينات برفق بطرف ماصة عريض التجويف ونفض العينات مرتين إلى ثلاث مرات طوال فترة الحضانة.

بتدوير الأنابيب التي تحتوي على خليط الحمض النووي والخرز المغناطيسي لفترة وجيزة. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة خمس دقائق على الأقل لجمع الخرز على جانب الأنابيب. يجب أن يبدو المحلول واضحا ، فهو يحتوي على الحمض النووي المخصب العضوي غير الميثيلي.

باستخدام أطراف التجويف العريضة ، قم بإزالة المادة الطافية التي تم تطهيرها بعناية دون إزعاج الخرزات وانقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف ومنخفض الارتباط ملليلتر. قم بتخزين العينات عند 20 أو 80 درجة مئوية. تم استخدام مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الحاد لتقييم الوفرة النسبية لثلاثة ضمنيات محددة للعضيات في إجمالي الحمض النووي الجيني وجزء الحمض النووي العضوي الذي تم الحصول عليه من كلتا الطريقتين.

بشكل عام ، تشير البيانات إلى أن طريقة الطرد المركزي التفاضلية تثري الميتوكوندريا بشكل تفضيلي. يظهر الجزء غير الميثيل من الحمض النووي الجيني الكلي المائل المجزأ ، إثراء كبير لكل من الضمنيات العضوية. تتوافق النسب المئوية للقراءات المعينة إلى الميتوكوندريا أو البلاستيدات الخضراء الصينية في الربيع والجينومات المرجعية للقمح المزروع من كريس مع نتائج QPCR.

ينتج عن الطرد المركزي التفاضلي الحمض النووي الأكثر إثرائا في الحمض النووي للميتوكوندريا وتجزئة الميثيل الحمض النووي الذي يعكس على الأرجح الوفرة الأصلية لجينومين عضويتين. تسميات العينة بما في ذلك E ، تحدد عينات مثالية و NE تحدد عينات غير مثالية. ومن المثير للاهتمام أن الشعة لم تغير وفرة العضوية.

في كلتا الطريقتين ، تتجاوز التغطية النظرية للجينومات المشار إليها في الميتوكوندريا أو البلاستيدات الخضراء تغطية 100x ، حتى عندما يتم تعدد الإرسال 12 مكتبة. يهاجر الحمض النووي الجيني الكلي كمسحة منتشرة في الرحلان الكهربائي للهلام بعد المجال ويتجاوز 50 كيلوقاعد. يتناقص حجم الجزء النووي بعد تجزئة الميثيل ، لكنه يظل متمركزا حول 50 كيلو قاعدة ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الميثيل فراكتيوانتز هو الأنسب لتسلسل القراءة الطويلة.

بمجرد إتقان ، يمكن إجراء تقنيتي استخراج الحمض النووي العضوي في غضون يوم إلى يومين ، من جمع العينات إلى تقييم المنتج النهائي ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. تقنية تجزئة الميثيل لديها القدرة على توسيع نطاق دراسات الحمض النووي العضوي بشكل كبير إلى عينات نادرة وصعبة ، نظرا لأن مدخلات الأنسجة منخفضة للغاية. ومع ذلك ، قد يظل الطرد المركزي التفاضلي مفضلا عندما يكون الحمض النووي للميتوكوندريا فقط مطلوبا للدراسات النهائية.

وبالمثل ، قد يتم تعديل خطوات الطرد المركزي لاستخراج الحمض النووي البلاستيدي بشكل تفضيلي إذا رغبت في ذلك. تنتج كلتا طريقتي استخراج الحمض النووي العضوي الحمض النووي الحمض النووي المناسب لتسلسل الجيل التالي ، لكن تجزئة الميثيل تنتج حمض نويا عالي المعدل الجزيئي وهو مثالي لتسلسل القراءة الطويلة.