أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة
مايو 18, 2017
وتستخدم المقايسات المنافسة الببتيد على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التجارب الجزيئية والمناعية. هذه الورقة تصف طريقة مفصلة لفي المختبر أوليغوببتيد-تنافس فحص كيناز وإجراءات المصادقة المرتبطة بها، والتي قد تكون مفيدة للعثور على مواقع الفسفرة محددة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم مواقع الفسفرة المحتملة المتعددة في وقت واحد وتحديد المواقع للتحقق اللاحق بواسطة طفرات موقع الفسفرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية حول دور التعديلات اللاحقة للترجمة في إشارات الخلية. تتيح هذه التقنية فحصا أوليا سهلا وصديقا للميزانية لمواقع الفسفرة والبروتين المهم.
امتدت الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص وعلاج الأمراض بما في ذلك الالتهاب والسرطان لأن الفسفرة هي حدث كيميائي حيوي مهم في مسارات الإشارات في الأمراض البشرية. سيساعد في العرض التوضيحي Sol-Bi Shin ، وهو طالب دراسات عليا من مختبري ، والذي أثناء قيامه بتوجيه الطفرات في الموقع. أولا ، اجمع بين 50 نانوغراما من البلازما pGEX JST NRF2 ، و 125 نانوغراما من التمهيدي الأمامي ، و 125 نانوجراما من التمهيدي العكسي ، وميكرولتر واحد من DNTP ، وخلط 2.5 وحدة من بوليميراز PFU DNA و 10x عازلة تفاعل على الجليد.
أضف الماء المقطر المعقم ليصل الحجم إلى 50 ميكرولترا. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لدمج الخصلة الطافرة ثم تبريد العينة على الجليد لمدة دقيقتين. أضف ميكرولتر واحد من إنزيم تقييد DPNI إلى العينة المبردة.
امزج العينة مع ماصة لطيفة ثم قم بالطرد المركزي للعينة لمدة دقيقة واحدة عند 13 ، 000 مرة G. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لهضم الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل للوالدين. ثم ارم خلايا الإشريكية القولونية فائقة الكفاءة مع طفرات endA1 و RACA1 على الجليد. أضف 50 ميكرولترا من خليط التفاعل إلى الخلايا المبردة واحتضنه على الجليد لمدة 30 دقيقة.
في هذه الأثناء ، سخني كتلة التسخين إلى 42 درجة مئوية. بمجرد اكتمال الحضانة ، سخني الخليط على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ثم بردي الخليط على الثلج لمدة دقيقتين. أضف مرق Lysogeny الدافئ مسبقا إلى الخلايا المحولة.
احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع رج المزيج عند 180 دورة في الدقيقة. ثم انشر الخلايا على ألواح أجار LB أمبيسلين واحتضن الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية. انقل مستعمرة واحدة إلى خمسة ملليلتر من مرق Lysogeny مع الأمبيسلين.
احتضان العينات طوال الليل عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة. استخرج عينة الحمض النووي باستخدام مجموعة إعداد صغيرة قياسية لتحليل تسلسل الحمض النووي. قم بتشغيل ما لا يقل عن 200 نانوجرام من بنية HDNA في محلل الحمض النووي للتحقق من التسلسل المتحور.
عبر عن بروتين NRF2 المتحور الذي تم التحقق من صحته وتنقيته. تحديد كمية NRF2 المتحولة المنتجة قبل إجراء فحص الكيناز. لبدء مقايسة منافسة الببتيد ، قم بإعداد محلول عازل كيناز 5X بتركيز أحادي فوسفات الأدينوزين يبلغ 500 ميكرومولار.
ثم قم بإذابة العينات المجمدة من النوع البري NRF2 البشري وثلاثة قلة الببتيد التي تحاكي مواقع الفسفرة AMPK ل NRF2. لكل ببتيد ، أثناء وجوده على الجليد ، اجمع 0.43 ملليغرام من الببتيد مع 0.15 ميكروغرام من AMPK و 0.4 ميكروغرام من NRF2 وستة ميكرولتر من 5X Kinase Buffer. أضف الماء المقطر المعقم لتحقيق حجم نهائي يبلغ 30 ميكرولترا.
ثم في منطقة محمية ، اضبط كتلة التسخين على 30 درجة مئوية. أضف ميكروكوري واحد من جاما 32P ATP إلى كل أنبوب، واخلط كل محلول جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. احتضان مخاليط التفاعل عند 30 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
أثناء الحضانة ، قم بإعداد 7.5٪ STS PAGE gel. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من المخزن المؤقت لعينة 10X STS إلى كل أنبوب واخلطه جيدا لإيقاف تفاعل الكيناز. قم بتشغيل العينات في الجل عند 70 فولت لمدة 20 دقيقة ثم عند 140 فولت لمدة ساعة واحدة.
عند الانتهاء من الرحلان الكهربائي للهلام ، قم بإزالة الجل عالي الإشعاع بعناية أسفل الخط الأزرق البروموفينول. انقل الجل برفق من العجلات إلى أنبوب زجاجي. ثبت الجل في محلول من 50٪ ميثانول و 40٪ ماء و 10٪ حمض الأسيتيك لمدة 20 دقيقة.
ثم ضع الجل برفق على ورق ترشيح وقم بتغطيته بغلاف شفاف. جفف الجل بمجفف جل مفرغ لمدة ساعة عند 80 درجة مئوية. تعريض الجل الجاف إما لشاشة الفوسفور أو فيلم الأشعة السينية لمدة 16 ساعة تقريبا لمدة يومين على التوالي.
استخدم Phosphorimager لإنشاء ملف TIFF أو Bitmap عالي الدقة للشاشة. لبدء فحص نشاط AMPK ، قم بإذابة عينات من AMPK والنوع المتحور والبري GST NRF2 على الجليد. اجمع بين 0.4 ميكروغرام من GST NRF2 المتحور مع 0.15 ميكروغرام من AMPK وستة ميكرولتر من المخزن المؤقت 5X Kinase.
أضف الماء المقطر المعقم ليصل الحجم إلى 30 ميكرولترا. قم بإعداد خليط تفاعل آخر بهذه الطريقة باستخدام 0.4 ميكروغرام من النوع البري GST NRF2. أضف ميكروكوري واحد من جاما 32P ATP إلى كل قارورة تفاعل.
ماصة الخلطات لأعلى ولأسفل عدة مرات ثم الطرد المركزي للمخاليط لفترة وجيزة. احتضان المخاليط عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في منطقة محمية ثم قم بإنهاء تفاعل كيناز بثلاثة ميكرولترات من عينة 10X STS المؤقتة. قم بتشغيل STS PAGE ، وقم بإصلاح الجل ، وجفف الجل باستخدام نفس شروط اختبار كيناز التنافسي.
قم بتعريض الجل لشاشة الفوسفور طوال الليل وامسح الشاشة باستخدام الفوسفوريجر. تم إجراء اختبار AMPK في المختبر في وجود ثلاثة بقايا قليلة الببتيدات 10 تحاكي مواقع فسفرة AMPK على NRF2 البشري. قدم قليل الببتيد الذي يحاكي موقع Serine 558 أكبر منافسة على فسفرة AMPK.
ثم تم تصنيع متحور NRF2 الذي حل محل Serine 558 بالألانين وتقييمه في اختبار النشاط في المختبر. لوحظ القليل جدا من فسفرة AMPK لمتحور S558 A مما يشير إلى أن AMPK يفسفرة NRF2 البشرية مباشرة في Serine 558. نظرا لأن الببتيدات ترتبط بشكل تنافسي بالبروتينات ، يمكن أيضا تطبيق مبدأ هذه الطريقة على تحديد الترجمة والتعديلات الأخرى مثل الأسيتيل وبقايا اللايسين وتفاعلات البروتين البروتيني.
لا تنس أن العمل مع النظائر الراديوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب بالفعل أخذ التدريب على سلامة النظائر الراديوية قبل تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لإجراء اختبارات كيناز تنافسية لـ oligopeptides في المختبر لتحديد مواقع الفسفرة المحددة. تعتبر هذه التقنية قيمة للفحص الأولي في بحوث الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الخلوي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- علم الأحياء الخلوي
- علم المناعة
الخلفية
- اختبارات تنافس الببتيد ضرورية في التجارب الجزيئية.
- الفسفرة تلعب دورًا حاسمًا في إشارات الخلايا.
- فهم الفسفرة يمكن أن يساعد في تشخيص وعلاج الأمراض.
- تتيح هذه الطريقة إجراء فحص اقتصادي لمواقع الفسفرة.
هدف الدراسة
- لتقييم مواقع الفسفرة المحتملة المتعددة في وقت واحد.
- لتحديد المواقع للتحقق من خلال متحولات موقع الفسفرة.
- لاستكشاف الآثار المترتبة على الفسفرة في أمراض مثل السرطان والالتهابات.
الطرق المستخدمة
- مزج كميات محددة من DNA البلازميد، والبادئات، والبوليميراز.
- إجراء طفرات موجهة للمواقع.
- إجراء اختبارات كيناز تنافسية لـ oligopeptides.
- التحقق من مواقع الفسفرة من خلال الإجراءات التجريبية.
النتائج الرئيسية
- تحديد مواقع الفسفرة المحددة لدراسة إضافية.
- عرض فعالية الطريقة في الفحوصات الأولية.
- رؤى حول دور التعديلات بعد الترجمة في الإشارة.
- تطبيقات محتملة في فهم آليات المرض.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة نهجًا موثوقًا لفحص مواقع الفسفرة.
- لها آثار مهمة للبحث في الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الخلوي.
- يمكن للدراسات المستقبلية أن تستفيد من هذه التقنية لاستكشاف الفسفرة المتعلقة بالأمراض.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables early-stage screening of phosphorylation sites to support target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying functional phosphorylation sites through peptide competition, it provides predictive confidence for downstream assay development and lead identification efforts. The approach reduces reliance on low-throughput mutagenesis, accelerating hypothesis testing in signaling pathway research relevant to oncology and inflammatory disease targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by screening multiple potential phosphorylation sites simultaneously.
- Operational Value: Enables rapid identification of sites for validation using phosphorylation site mutants.
- Strategic Value: Supports predictive confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream kinase assay standardization.
- Operational Value: Delivers quantitative phosphorylation readouts amenable to high-throughput adaptation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness for compound effect evaluation on phosphorylation dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by linking phosphorylation to signaling in cancer and inflammation.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via mutant-based confirmation.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanistic roles of post-translational modifications.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to lead identification, particularly for kinases and signaling pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through site-specific phosphorylation screening.
- Screening: Enables assay readiness via quantitative, reproducible phosphorylation measurements.
- Analytics: Generates comparative readouts that help prioritize sites for functional validation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating sites in disease-relevant contexts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable screening platform across multiple targets and kinase families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility of phosphorylation site assessment.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by focusing resources on validated sites.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on phosphorylation-driven mechanism confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in kinase assay design and radioactive detection methods.
- Dependent on access to phosphorimager or x-ray film detection infrastructure.
- Necessitates standardization across peptide synthesis and mutant protein expression.
- Involves adaptation considerations for non-radioactive detection systems.
- Limited by the need for prior knowledge of consensus phosphorylation motifs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
8:31
Conclusion
7:39
Results: In Vitro AMPK Assays with Competitive Oligopeptides or a Site-specific Mutant Protein
1:05
Site-directed Mutagenesis of pGEX-Nrf2
3:45
In Vitro Competitive 5' Adenosine Monophosphate-activated Protein Kinase (AMPK) Assay
6:13
In Vitro AMPK Activity Assay with a Site-specific Mutant
