قياس التصبغ البطن في ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر

الهدف العام لهذه المنهجية هو تحديد تصبغ البطن بسرعة في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التطوري مثل تحديد المواقع الجينية التي تكمن بدورها في مورفولوجيا التباين الخاصة بالثقة وفهم تطور وتطور الأنماط الظاهرية المورفولوجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمستخدمين بقياس جوانب مختلفة من تصبغ البطن بشكل غير مدمر بما في ذلك انتشار وعمق التصبغ.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على تصبغ بطن ذبابة الفاكهة السوداء ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع ذبابة الفاكهة الأخرى وتكييفها بسهولة لقياس أنماط التصبغ في الحشرات الأخرى والأصناف الحيوانية. قبل التصوير ، يمكن تخزين الذباب في 70٪ من الإيثانول للحفاظ على تصبغه. يتطلب التصور لوحة تثبيت.

قم بتحميل طبق بتري 60 ملم بحوالي 10 ملليلتر من أجار 1.25٪ في الماء. تحت المجهر ، استخدم ملقطا دقيقا لحفر خندق بطول 20 ملم وعرض ملليمترين وعمق ملليمتر واحد في الجل. يمكن عمل عدة خنادق في طبق واحد.

ثم قم بتضمين الذباب في الخندق مع وضع السطح للتحليل فوق سطح الهلام مباشرة. في هذه الحالة ، يكون الجانب الظهري ذا أهمية. الآن ، املأ الطبق بنسبة 70٪ من الإيثانول حتى يتم غمر الذباب بالكامل.

هذا يقلل من الانعكاسات من البشرة التي يمكن أن تحجب نمط التصبغ. الآن ، ابدأ برنامج التصوير والكاميرا الرقمية المتصلة بالمجهر. بالنسبة لمصدر الضوء ، يكون الضوء البارد من جهاز معقوف مزدوج وافيا.

في برنامج تحليل الصور ، اضبط نوع الصورة على 8 بت. ثم في برنامج التقاط الصور ، قم بتبديل ملف Live الإعداد لفتح نافذة عرض للكاميرا. اضبط نوع الصورة على تدرج الرمادي.

الآن ، اضبط مصدر الضوء على أقصى شدة له وضع الأضواء على بعد حوالي 120 ملم من المسرح. اضبط المجهر على تكبير 60 مرة بحيث يكون عرض مجال الرؤية ثلاثة ملليمترات. ثم ضع ميكرومتر المرحلة المليمترية في مجال الرؤية وركز عليه.

بالعودة إلى البرنامج ، اضبط وقت التعرض لعرض الميكرومتر باستخدام الحقل الموجود في مربع التعريض الضوئي. ثم اضبط المقياس. افتح أداة الخط المستقيم وارسم طول ملليمترين على طول ميكرومتر المرحلة.

ثم أدخل هذا الطول ضمن خيار تعيين المقياس. يجب أن تعرض النافذة بعد ذلك المقياس بالبكسل لكل ميكرون. لاحظ المقياس ووافق على التعديلات.

الآن ، ارجع إلى برنامج التقاط الصور واستخدم الأمرين Stop و Snap لالتقاط صورة لميكرومتر المسرح. ثم ارجع إلى برنامج تحليل الصور واحفظ الصورة كملف Tiff. الآن ، ركز على خط الوسط الظهري للذبابة المركبة.

يجب وضع خط الوسط بشكل مستقيم للحصول على أفضل نتائج التصوير. ادفع الأجنحة وأي هياكل أخرى واقتشية جانبا واضبط الإضاءة لإضاءة البشرة بشكل أفضل. بعد ذلك ، قم بتعيين التعريض الضوئي في برنامج التقاط الصور باستخدام الرسم البياني لقيمة البكسل كدليل لالتقاط نطاق البكسل الكامل للصورة دون تشبع ، وبالتالي زيادة التباين إلى أقصى حد.

احتفظ بهذا التعريض الضوئي والإضاءة طوال التجربة. الآن ، قبل التقاط صورة ، تأكد من أن أجزاء البطن ذات الأهمية معروضة. ثم التقط صورة واحفظ الصورة مع رقم معرف العينة في اسم الملف.

استخدم التنسيق الموضح في البروتوكول المكتوب. يستخدم هذا التحليل ماكرو قدمه المؤلفون. يجب تضمين جميع سلسلة الصور المراد تحليلها في نفس مجلد الملفات.

الآن ، ابدأ الماكرو واتبع الأوامر المطلوبة. أولا ، حدد موقع الملفات المخزنة. ثم حدد الموقع الذي يجب تخزين بيانات التحليل فيه.

بعد ذلك ، أدخل عدد الأحرف التي تم استخدامها في أسماء الملفات حتى يقرأ البرنامج سلسلة الصور بشكل صحيح. المطالبة التالية هي عرض منطقة الاهتمام. هنا ، أدخل عدد وحدات البكسل على طول الشريط الأمامي الخلفي الذي يحتاج إلى تحليل.

الآن ، عند المطالبة ، حدد خيار تحليل الصورة الأولى من السلسلة. الخيارات الأخرى هي تحليل الصورة التالية في السلسلة أو الخروج من التحليل. يتم تحديد أداة الخط تلقائيا.

استخدمه لتحديد خط الوسط على الصورة عن طريق رسم خط على طوله في الاتجاه الأمامي إلى الخلفي. بعد ذلك ، اتبع مطالبات الماكرو لتحديد الحافة الخلفية ل Tergite4 باستخدام أداة الخط. يتم توفير أداة الخط لرسم الخط من حافة خط الوسط الخلفي إلى الحافة الجانبية اليمنى بحيث يكون مركز الخط خلفيا للحافة الخلفية لشريط الصباغ.

ثم حدد الحافة الأمامية ل Tergite4 باستخدام أداة الخط. ارسم خطا من حافة خط الوسط الأمامي إلى الحافة الجانبية اليمنى. يجب أن يجلس منتصف الخط المحدد بمربع أبيض على الحافة الأمامية للبشرة المصطبغة قليلا.

باستخدام هذه المعلومات ، يقوم الماكرو الآن بإنشاء ملف تعريف تصبغ. ومع ذلك ، قد يكون الملف الشخصي غير دقيق إذا عبرت شعيرات أو عيوب أخرى الشريط الذي يتم قياس المظهر الجانبي على طوله. لتصحيح ذلك ، حدد ملف معاينة حية في نافذة الرسم البياني واضبط الخط بحيث يكون ملف التعريف سلسا.

لكي يلتقط شريط تحليل الصور الجوانب المختلفة للتصبغ بدقة ، من الضروري تحديد منطقة التحليل التي سيكون لها الحد الأدنى من الضوضاء الناجمة عن عدم انتظام الصورة أو العينة. انتقل الآن إلى تحليل Tergite3 في نفس الصورة ثم انتقل إلى الصورة التالية. تم استخدام الإجراء الموصوف لاستكشاف التغيير المعروف في تصبغ البطن الناجم عن درجة حرارة التربية.

تم فحص الترجيت الثالث والرابع عدة مرات تحت إضاءة وتعريضات مختلفة. تم استكشاف جوانب مختلفة من التصبغ. وعلى وجه التحديد ، وجد أن أشرطة التصبغ كانت أوسع عندما يتم تربية الذباب في درجات حرارة أكثر برودة.

ثم تمت مقارنة القيم المحسوبة بالمقاييس الذاتية العامة التي تم إجراؤها على نفس الذباب من قبل خمسة مراقبين مختلفين. في تقييم 45 ذبابة أنثى ، كان متوسط الترتيب المرصود لعرض شريط تصبغ البطن الرابع مرتبطا ارتباطا وثيقا بالقياس الآلي للماكرو. تم أيضا قياس نفس شريط التصبغ يدويا باستخدام برنامج التصوير.

ارتبطت هذه النتائج ارتباطا وثيقا بالقياسات التي تم إنشاؤها باستخدام الماكرو. ثم تم اختبار البرنامج لقياس التصبغ في طفرات خشب الأبنوس الأنثوية المعروفة بزيادة التصبغ في نطاقات الصباغ الثالثة والرابعة. تم استخدام الطريقة أيضا لقياس العصابات البطنية الخامسة والسادسة للإناث من النوع البري.

قدمت التقنية الآلية دائما قياسات مفيدة لكثافة الصباغ وحجم النطاق. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تصبغ البطن بسرعة وبدقة في ذبابة الفاكهة. يتطلب إتقان هذه التقنية في الغالب الاستخدام العميق للملقط.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء جزء التصوير من هذه التقنية بمعدل 50 عينة في الساعة. يمكن استخراج مقاييس التصبغ من هذه الصور بوتيرة 70 صورة في الساعة.