موقع التكامل ثنائي الاتجاه للفيروسات القهقرية منهجية ير والتحليل الكمي للبيانات سير العمل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مواقع تكامل نواقل الفيروسات القهقرية في الجينوم المضيف وتحديد الترددات النسبية لمجموعات الخلايا النسيلة التي تشترك كل منها في نفس موقع التكامل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في العلاج الجيني بالفيروسات القهقرية ، مثل أي جزء من ناقل الجينوم المضيف قد تم دمجه ، وكيف ستعاد تكاثر الخلية المعدلة وراثيا بعد الزرع ، وكيف تختلف وظيفيا. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكن تحليل تسلسلات مواقع التكامل الرجعي بدقة وحساسية أعلى عن طريق تسلسل كل من تقاطعات الحمض النووي للمضيف المتجه في المنبع والمصب في وقت واحد.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لسلامة النواقل والخلايا المهندسة الجينات في دراسات العلاج الجيني ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات البيولوجيا الأساسية الأخرى للتحقيق في سلوك الخلية الفردية في الجسم الحي. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في تحديد تركيز الحمض النووي ونسبة الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر من الحمض النووي الجيني المراد تحليله. بعد ذلك ، قم بتخفيف ميكروغرام إلى ميكروغرام من عينة الحمض النووي الجيني إلى حجم نهائي يبلغ 170 ميكرولترا من محلول الحمض النووي الجيني باستخدام الماء الخالي من النوكلياز.

قم بإعداد تفاعل PCR سعة 200 ميكرولتر عن طريق خلط ما يلي في أنبوب طرد مركزي دقيق. 2.5 ميكرولتر لكل من بادئات البيوتين الخاصة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، أو ما مجموعه 10 ميكرولتر لأربعة بادئات خاصة بفيروس العدسات ، و 20 ميكرولتر من محلول بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة 10X ، وأربعة ميكرولترات من 10 ملليمولار dNTPs ، وثلاثة ميكرولترات من بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة ، و 163 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني. قسم المحلول بالتساوي إلى أربعة أنابيب PCR وقم بإجراء دورة تمديد واحدة في ظل الحالة التالية.

94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 56 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 4 درجات مئوية للتخزين. اجمع جميع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأربعة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر. اتبع إجراء الشركة المصنعة لمجموعة تنقية PCR ، وقم بإزالته ب 50 ميكرولتر من محلول الشطف.

استعد لهضم 100 ميكرولتر عن طريق إضافة ما يلي إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. 50 ميكرولتر من الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من 10X Buffer A ، وميكرولترين من إنزيم RSAI ، و 38 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. احتضان عند 37 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من إنزيم CviQI إلى التفاعل واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. عند اكتمال هضم RSAI و CviQI ، تابع على الفور بنهاية حادة. قم بإعداد خليط سعة 4.5 ميكرولتر يحتوي على 2.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي I ، وجزء كبير ، و 2 ميكرولتر من 10 ملليمولار dNTPs.

انقل 1 ميكرولتر من الخليط إلى عينة الحمض النووي. سيكون الحجم الإجمالي 102 ميكرولتر. تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتحتضن على حرارة 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

تابع على الفور ربط حبة الستربتافيدين عند اكتمال الحضانة. قم بإعداد حبات الستربتافيدين عن طريق دوامة محلول الخرزة لفترة وجيزة ونقل 50 ميكرولتر إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق سعة ملليلتر. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام حامل مغناطيسي واغسل الفاصوليا ب 200 ميكرولتر من محلول الربط.

أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من محلول الربط وضع الأنبوب بعيدا عن الحامل المغناطيسي. انقل 100 ميكرولتر من عينة الحمض النووي إلى 100 ميكرولتر من محلول الخرزة المعلق واخلطه بعناية عن طريق سحب العينة لتجنب أي رغوة في المحلول. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات على عجلة دوارة.

استخدم الحامل المغناطيسي لالتقاط الخرزات والتخلص من المادة الطافية. اغسل الخرزات مرتين في 400 ميكرولتر من محلول الغسيل ومرتين في 400 ميكرولتر من 1X T4 DNA ligase Buffer. أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من 1X T4 DNA ligase المؤقت وضعه بعيدا عن الحامل المغناطيسي.

يجب إجراء ربط الرابط مباشرة بعد ربط حبة الستربتافيدين. قم بإعداد محلول تفاعل ربط 400 ميكرولتر عن طريق خلط ما يلي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر. 0.5 ميكرولتر من رابط الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من 10X T4 DNA ligase buffer ، و 20 ميكرولتر من 5X T4 DNA ligase buffer ، و 5 ميكرولتر من T4 DNA ligase ، و 164.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، و 200 ميكرولتر من الخرز المعلق.

ضع أنبوب التفاعل على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات. اغسل الخرزات مرتين بمحلول الغسيل ، ومرتين باستخدام 1X مخزن بوليميراز DNA القابل للحرارة. أعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولترا من 1X عازلة DNA polymerase PCR المقاومة للحرارة ، وضعها بعيدا عن الحامل المغناطيسي.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد تفاعل PCR سعة 200 ميكرولتر عن طريق إضافة ما يلي إلى الخرزات المعلقة. 10 ميكرولتر من 1 لتر برايمر ، 10 ميكرولتر من 1R-primer ، 20 ميكرولتر من التمهيدي Link1 ، 10 ميكرولتر من 10X مخزن بوليميراز DNA المقاوم للحرارة ، أربعة ميكرولترات من 10 مللي مولار dNTPs ، ثمانية ميكرولترات من بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة ، و 88 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. Aliquot خليط التفاعل في أربعة أنابيب PCR وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مع الشرط التالي.

94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، 25 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 56 درجة مئوية لمدة 25 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، وتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اجمع جميع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأربعة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل. اتبع إجراء مجموعة تنقية PCR وقم بإزالتها ب 50 ميكرولتر من محلول الشطف.

تحديد تركيز الحمض النووي ونسبة الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية. يمكن الآن تخزين الحمض النووي عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا للخطوة التالية. نظرا لأن إجراءات التضخيم الخاص بالتقاطع الأيسر والتقاطع الأيمن متطابقة باستثناء البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، عرض تضخيم التقاطع الأيسر فقط.

قم بإعداد تفاعل PCR سعة 50 ميكرولتر عن طريق خلط ما يلي في أنبوب PCR. خمسة ميكرولتر من الحمض النووي ، وخمسة ميكرولترات من 10 ميكرومولار 2 لتر برايمر ، وخمسة ميكرولترات من 10 ميكرومولار برايمر Link2 ، و 5 ميكرولترات من 10X من بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة 10X ، وميكرولتر واحد من 10 مللي مولار dNTPs ، وميكرولترين من بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة ، و 27 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بالحالة التالية.

94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ومن 8 إلى 15 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و56 درجة مئوية لمدة 25 ثانية ، و72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، وتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استخدم مجموعة تنقية PCR لتنقية الحمض النووي وتشطيفه ب 50 ميكرولترا من محلول الشطف. تحديد تركيز الحمض النووي ونسبة الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر.

تتمثل الخطوة الأخيرة في إنشاء مكتبات تسلسل الوصلات اليمنى واليسرى في تحليل اختلافات طول PCR Amplicon عن طريق إجراء الرحلان الكهربائي الشعري. تظهر هذه النتيجة التمثيلية أطوال متفاوتة من أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل في مواقع تكامل نواقل الفيروسات العدسية لكل من تقاطعات مضيف النواقل الأولية والنهائية. علامة حجم الحمض النووي موجودة في حارة M.

بعد تسلسل مضخمات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم إجراء تحليل تسلسل موقع التكامل الحسابي باستخدام برنامج برمجي داخلي. يولد مقايسة موقع التكامل ثنائي الاتجاه أحجاما مختلفة من أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل من تقاطعات مضيف المتجهات الأولية واللاحقة التي يتم تصورها بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري. كشفت مقارنة بين النسبة المئوية للتكامل في الجينات Alu و L1 لتكرارات ناقلات الفيروسات العدسية في خلايا إعادة توطين الفئران المتوافقة مع البشر داخل أحداث التكامل العشوائية التي ولدت السيليكو أن مواقع التكامل غنية بشكل كبير بالجينات.

تم حساب ترددات الكشف النسبية لتكامل المتجهات باستخدام عدد التسلسل فقط لتقاطعات موقع التكامل التي تولد مضخمات PCR أصغر من 500 نقطة أساس. يمكن تحليل ما يقرب من 77٪ من المتجهات كميا من خلال النهج ثنائي الاتجاه. في استراتيجية القياس الكمي النسيلي ، نفترض أن كل استنساخ فردي يشترك في نفس المتجه المتجه.

يتم الجمع بين الترددات النسبية للتقاطعات اليمنى واليسرى لتمثيل الكميات النسبية للمجموعات النسيلة ، أو QVI. يوضح نظام الألوان هذا الترددات النسبية ل 44 نسخة QVI في خلايا إعادة توطين الفأر المتوافقة مع البشر. استنادا إلى تحليل التكامل العشوائي في silico 10 ، 000 ، من المتوقع المبالغة في تقدير الترددات النسيلة بمقدار 1.25 ضعفا عند استخدام إنزيمات فكرة GTAC ، ومن المتوقع المبالغة في تقدير 2.56 عند استخدام إنزيم الشكل TCGA.

بمجرد إتقانها ، يمكن تقسيم هذه التقنية إلى أجزاء وإكمالها في غضون يومين ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن خطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل حساسة للغاية ، ويجب اتخاذ الاحتياطات لتجنب أي تلوث. مهدت هذه التقنية الطريق لفحص سلامة نواقل الفيروسات القهقرية العلاجية ، واستكشاف أنماط إعادة التوطين على المدى الطويل لاستنساخ الخلايا الجذعية المكونة للدم بعد الزرع في المكاك الريسوسية.