جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

الهدف من هذا الإجراء هو عزل وتحديد خطوط الخلايا بالضربة القاضية النسيلة الناتجة عن نوعين من تحرير الجينوم بوساطة CRIPSR / Cas9. تكتشف إحدى الطرق خروج المغلوب للبروتين الناجم عن الانضمام النهائي غير المتماثل بينما تكتشف الأخرى الاضطرابات الجينومية الناتجة عن الإصلاح الموجه بالتماثل. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في مجال البيولوجيا الجزيئية ، حيث يعد توليد خطوط الخلايا ذات الاضطرابات الجينية أداة مهمة في تشريح وظيفة الجينات.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سريعة وعالية الإنتاجية نسبيا يمكن تنفيذها بسهولة باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية. يقدم الانضمام النهائي غير المتماثل عمليات حذف أو إدخالات صغيرة ، ويتم تقييمه بواسطة لطخة مناعية نقطية ، بينما يسمح الإصلاح الموجه بالتماثل باضطرابات أكبر وأكثر دقة ، ويتم تقييمه بواسطة مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تستخدم هذه التجربة خلايا T-REx-293 المستزرعة في وسائط DMEM، مكملة بنسبة 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

قبل الحمل ، قم بوضع الخلايا على ست ألواح بئر وقم بتضمين بئر للتحكم غير المنقول. تنمو الخلايا إلى حوالي 70٪ التقاء. قم بنقل الخلايا ب 2.5 ميكروغرام من البلازميد الكلي باستخدام بروتوكول نقل تجاري.

لنقل الخلايا بدون اختيار ، استخدم 2.5 ميكروغرام من بلازميد Cas9-sgRNA. لنقل الخلايا مع الاختيار ، استخدم 0.75 ميكروغرام من Cas9-sgRNA1 ، و 0.75 ميكروغرام من Cas9-sgRNA2 ، وميكروغرام واحد من قالب إعادة التركيب المتماثل. احتضان الخلايا المنقولة والتحكم غير المنقول عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.

بالنسبة للخلايا التي تم نقلها بالاختيار ، ابدأ في اختيار الدواء عن طريق معالجة الخلايا بالدواء المناسب ، وهو Neomycin في هذه الحالة. أعد اللوحة المكونة من ستة آبار إلى الحاضنة. راقب الخلايا المعالجة مرة واحدة يوميا للتحقق من معدلات موت الخلايا ، حتى تموت جميع الخلايا في التحكم غير المنقول.

لعزل التجمعات النسيلة ، قم أولا بتنمية الخلايا إلى التقاء 100٪ في البئر الأصلي بعد الاختيار. بعد ذلك ، قم بعمل تخفيفات متسلسلة للخلايا وعد الخلايا. نظرا لأن التوليد الصحيح للمستعمرات أحادية النسيلة هو المفتاح للحصول على ضربة قاضية كاملة ، يجب توخي الحذر لتحديد التخفيف الصحيح لخلايا الجلوس بالكثافة المطلوبة.

بمجرد تحديد التخفيف الصحيح ، ضع الخلايا في 96 لوحة بئر بكثافة 0.33 خلية لكل بئر. يعد الجلوس ثلاث لوحات 96 = بئر نقطة انطلاق جيدة لضمان عزل أكثر من استنساخ صحيح. على مدى أسبوعين إلى أربعة أسابيع ، راقب المستعمرات حتى تصبح المستعمرات مرئية للعين.

تظهر هذه الصور التمثيلية مستعمرات في مراحل مختلفة من النمو. خلية واحدة في الجلوس ، وخلايا في اليوم الخامس ، ومستعمرة راسخة في اليوم 10. باستخدام طرف ماصة معقم، اختر المستعمرات المرئية بعناية ودقة، وأعد وضعها في آبار جديدة لتشجيع نمو طبقة واحدة.

استمر في نمو الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يتم فحص المرشحين بالضربة القاضية بدون اختيار بواسطة اللطخة المناعية النقطية لتقييم منتج البروتين بطريقة عالية الإنتاجية. بعد زراعة المستنسخة الفردية إلى التقاء 50 إلى 100٪ ، قم بإزاحة الطبقة الأحادية للخلايا عن طريق سحب العينات داخل البئر.

Aliquot 90 ميكرولتر من الحجم الإجمالي 100 ميكرولتر من كل بئر إلى أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق. لأغراض هذا الفيديو ، ستتم معالجة عينتين فقط. قم بالدوران عند 6 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة الوسائط ، وقم بتحليل منصة الخلية في 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 1X SDS.

أضف 90 ميكرولترا من الوسائط الجديدة إلى ما تبقى من الخلايا في البئر ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمواصلة نشر الخلايا. ماصة ميكرولتر واحد من تحلل الخلية على غشاء نيتروسليلوز جاف لتشكيل نقطة. امسح كل عينة مرتين على غشاءين منفصلين ، مما يؤدي إلى إنشاء نمطين متطابقين من العينات.

سد الأغشية في 5٪ حليب في TBST في درجة حرارة الغرفة ، مع التأرجح ، لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة ، قم بمسح الأغشية بالأجسام المضادة الأولية عند تخفيف الأجسام المضادة الأولية الموصى بها ، و TBST بالإضافة إلى 5٪ حليب. على غشاء واحد ، استخدم الجسم المضاد الأساسي ضد البروتين المستهدف ، ELAVL1 في هذه التجربة.

على الغشاء الآخر ، استخدم الجسم المضاد الأساسي لبروتين التحكم الذي لا يتوقع أن يتغير ، يتم استخدام PUM2 هنا. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي من كل لطخة ، وأضف TBST ، واحتضن لمدة خمس دقائق.

بهذه الطريقة ، اغسل البقع ثلاث مرات باستخدام TBST. بعد ذلك ، أضف إلى كل غشاء الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP المناسب ، وامسح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة ، اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة خمس دقائق في كل مرة.

ضع محلول ركيزة كيميائي على البقع ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، وقم بتصوير الأغشية الملطخة على جهاز تصوير كيميائي رقمي. أخيرا ، قم بتحديد كثافة النقاط للبروتينات المستهدفة والتحكم باستخدام البرنامج المناسب ، وقم بتحليل النتائج كما هو موضح في بروتوكول النص. يتم فحص المرشحين الذين لديهم علامة المقاومة القابلة للتحديد بواسطة مستعمرة PCR.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق تكرار المستعمرات الفردية في صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا ، وتنميتها إلى التقاء بنسبة 100٪ لتحضير محللات الخلايا. قم بإزالة الوسائط من مجموعة واحدة من المستنسخة ، وأعد تعليق الخلايا من كل بئر في 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت للاستخراج من مجموعة أدوات تحضير الحمض النووي التجارية ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 ملليلتر. سخني المحلول إلى 96 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم اتركيه يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.

أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتثبيت إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق واخلطه جيدا. لتحديد الخطوط الطافرة من النوع البري والأحادية أو ثنائية الأليل بواسطة مستعمرة PCR ، صمم مجموعتين منفصلتين من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم المناطق حول أذرع التماثل بناء على التكامل الناجح أو غير الناجح لشريط المقاومة. على كل جانب ، استخدم برايمر مشترك يلدن خارج ذراع التماثل.

لاختبار الأليل من النوع البري ، استخدم التمهيدي المشترك مع التمهيدي المزدوج المقابل المكمل للتسلسل الداخلي الذي يمتد على منطقة التماثل. لاختبار الطفرة المطلوبة ، استخدم التمهيدي المشترك مع برايمر مزدوج آخر ، مكمل لشريط المقاومة المدرج. لكل عينة يتم اختبارها ، قم بإعداد خليط تفاعل يحتوي على ما يلي ، 0.5 ميكرولتر من محللة الخلية ، و 1.25 ميكرولتر من 10X KOD buffer ، و 0.75 ميكرولتر من 25 ملليمولار كبريتات المغنيسيوم ، و 1.25 ميكرولتر من اثنين من dNTPs ملليمولي ، و 0.375 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، و 0.375 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، و 0.25 ميكرولتر من بوليميراز KOD ، و 7.75 ميكرولتر من الماء.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الشروط التالية ، 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 25 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، ودرجة حرارة انصهار التمهيدي لمدة 10 ثوان ، و 70 درجة مئوية لمدة 20 ثانية لكل كيلوبايت. بعد ذلك ، تصور منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. تم إجراء تحرير الجينوم باستخدام الانضمام النهائي غير المتماثل لإنشاء خطوط خروج المغلوب ELAVL1 متبوعة ببقعة مناعية نقطية ، والبحث عن ELAVL1 و PUM2. تم تمييز المستنسخة التي أظهرت إشارة تحكم قليلة بعلامة X ، واستبعدت من مزيد من التحليل.

تم اختبار المستنسخة ذات إشارات ELAVL1 المنخفضة بواسطة اللطخة الغربية. يشار إلى المرشحين المؤكدين باللون الأخضر ، ويشار إلى المرشحين الملغين باللون الرمادي. يوضح هذا الرسم نسب ELAVL1 للتحكم في إشارة البروتين بترتيب متزايد.

في معظم الحالات ، تم تحديد المجموعات النسيلة ذات أقل إشارة ELAVL1 النسبية بشكل صحيح على أنها ضربة قاضية. تم فحص المرشحين الذين تم إنشاؤهم بواسطة طريقة الإصلاح الموجهة للتماثل بواسطة مستعمرة PCR ، ومنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تم تصورها بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. تظهر أمثلة على النتائج باستخدام الاشعال التي تمتد عبر تقاطع التكامل المنبع باستخدام بادئات داخلية داخلية وضربة قاضية داخل الاشعال.

تم التحقق من صحة البادئات لأول مرة في كل من الخلايا الأبوية والخلايا المختارة بالجملة. يتم عرض النتائج من 24 نسخة مرشحة فردية مع رقطقة الفرقة المتوقعة لاستنساخ الحذف من النوع البري والضربة القاضية والحذف أحادي. تشير الأسهم السوداء إلى منتجات التضخيم الصحيحة ، وتشير النجوم إلى استنساخ ضربة قاضية ثنائية الأليل.

تم التحقق من صحة الخطوط الطافرة ثنائية الأليل بواسطة اللطخة الغربية. يستخدم الانضمام النهائي غير المتماثل قص Cas9 واحد وفحصا مستقلا عن الاختيار ، مما يتطلب القليل من الإعداد المسبق ، ويمكن أن يحدد فحص استنساخ الضربة القاضية بواسطة البقع النقطية بسرعة ما إذا كان جيل خروج المغلوب ناجحا. يكتشف الفحص المستند إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل بدقة المرشحين الصحيحين الذين يعانون من اضطرابات جينومية كبيرة ناتجة عن الإصلاح الموجه بالتماثل.

تمكن هذه التقنيات الباحثين في البيولوجيا الجزيئية من تحديد الضربات القاضية بسهولة وكفاءة ، مما يسمح لهم باستكشاف العمليات الخلوية الطبيعية أو المختلة باستخدام خطوط الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتحديد خطوط الخلايا بالضربة القاضية النسيلة التي تم إنشاؤها بواسطة تحرير الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9.