Name: كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: تعلم تقنية كروماتين إمونوبريسيبيتاتشن (ChIP) لدراسة علامات الهيستون في خلايا T الفأرية. هذه الطريقة الفعالة والقابلة للتكرار تساعد الباحثين على فهم تنظيم الكروماتين في الخلايا المناعية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن ممتنون ل P. كيس و T. شميدت-ول للمساعدة التقنية الممتازة. وقد حظي هذا العمل بدعم من منحة البحوث التعاونية TRR81 وبرنامج هيزنبرغ (بو 1639 / 5-1) التابع لمؤسسة البحوث الألمانية، وجمعية ماكس بلانك، و إكسك 294 في فرايبورغ، ومجموعة التميز لنظام القلب الرئوي (إكبس) في جيسن إلى مرض السل

ملاحظة: يتم سرد كافة المخازن المؤقتة والمتوسطة المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1 . اليومان 1 و 2 1. يشابك الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس خلايا T من لوحة 6 جيدا إلى أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 271 س ز. ريسوسبيند خلية بيليه في 30 مل من إدمم خلية ثقافة المتوسطة وعد الخلايا باستخدام غرفة نيوبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قسامة من 20 × 10 6 خلايا في أنابيب 50 مل جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الفورمالديهايد (فما) إلى تركيز النهائي 1٪ مباشرة إلى وسط زراعة الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تنبيه: فما سامة إذا استنشقت، لذلك العمل تحت غطاء الدخان وارتداء المعدات الواقية المناسبة. أيضا، يرجى التعامل مع النفايات فم وفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1/8 الحجم من 1 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 7.0، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5دقيقة في 4 درجات مئوية و ~ 271 زغ وغسل مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنابيب 1.5 مل. </li></ol> 2. خلية تحلل والكروماتين القص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريسوسبيند الخلية بيليه في 1 مل من سدز تحلل العازلة واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى أنبوب سونيكاتيون وأداء القص باستخدام أولتراسونيكاتور تركز وفقا للإعدادات المشار إليها في الجدول 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد القص، ونقل العينات إلى 1.5 مل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و ~ 18000 x ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف إلى أنابيب جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 50 ميكرولتر لتحديد كفاءة القص وفقا للخطوة 3 والمفاجئة تجميد المحللة في النيتروجين السائل. تخزين المحللة في أليكوتس ذات الاستخدام الواحد في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. تحديد كفاءة القص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من العازلة شطف إلى 50 و #181؛ L من كل المحللة المقطعة واحتضان عند 65 درجة مئوية خلال الليل، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العازلة تي و 4 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز (0.2 ميكروجرام / ميكرولتر التركيز النهائي). مزيج واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين K (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي) لكل عينة واحتضان لمدة 2 ساعة عند 55 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى أنبوب هلام مناسبة لاستخراج الكحول الفينول / الكلوروفورم / الإيزوميل. مقبض وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) ويهز الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 24 درجة مئوية و ~ 16000 زغ ونقل المرحلة العليا إلى أنابيب جديدة. تنبيه: الفينول، الكلوروفورم، والكحول الإيزواميلي هي سامة إذا استنشاق وتآكل. والعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. أيضا، التعامل مع الفينول، الكلوروفورم، و أسوميل الكحول أس النفاياتوفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكرار مرة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع التعديلات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الغشاء مرتين. بعد غسل الماضي، وترك أنبوب مفتوح لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتبخير الايثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على شطف، إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة، وتدور الأنبوب لمدة 1 ثانية ل رطب بشكل صحيح الغشاء، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة قبل التنازل عن الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 24 ° C و ~ 17،900 x ز. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الحمض النووي المنقى على فلوروميتر باستخدام مجموعة عالية الحساسية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل ما يقرب من 500 نانوغرام من الحمض النووي المنقى على هلام الاغاروز 1.8٪ وحوالي 1 نانوغرام على نظام الكهربائي باستخدام مجموعة عالية الحساسية. ملاحظة: سيز المتوقعه من شظايا الحمض النووي ما بين 200 و 500 نقطة أساس. </li></ol> اليومان 3 و 4 4. مناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 1 حجم من المحللة قص مع 5 مجلدات من المخزن المؤقت التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بريكليري مع 30 ميكرولتر / مل البروتين وحبات الاغاروز (أعدت وفقا للتذييل ألف ) لمدة 30 دقيقة في حين الدورية في الغرفة الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في ~ 750 x ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10٪ من المدخلات وتخزينه في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة المبلغ المطلوب من المحللة في أنابيب جديدة (انظر الجدول 3 لمزيد من التفاصيل). إضافة الأجسام المضادة المطلوبة لكل أنبوب (انظر الجدول 3 لمزيد من التفاصيل) وتناوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من البروتين وحبات واحتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية في حين الدورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخرز مع 1 مل من العازلة منخفضة الملح، العازلة عالية الملح، العازلة ليكل، والعازلة تي (لكل غسل، واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في حين الدورية وأجهزة الطرد المركزيلمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 950 زغ). انظر الجدول 3 للحصول على التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 110 ميكرولتر من العازلة شطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، فورتيكسينغ كل 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 950 زغ ونقل 100 ميكرولتر من طاف إلى أنبوب 1.5 مل جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 4.7-4.8 مع 100 ميكرولتر من العازلة شطف والجمع بين إيليتس. إضافة شطف عازلة تصل إلى 200 ميكرولتر لإدخال العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان جميع العينات بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li></ol> يوم 5 5. دنا تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من العازلة تي إلى كل شطافة و 8 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز (0.2 ميكروجرام / ميكرولتر التركيز النهائي). مزيج واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين K (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي) إلى كل شطافة واحتضان لمدة 2 ساعة عند 55 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى هلامأنبوب مناسب ل فينول / كلوروفورم / إيسواميل كحول إستخراج؛ مقبض وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) ويهز الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 24 درجة مئوية و ~ 16،000 x ز. نقل المرحلة العليا إلى أنابيب جديدة. تنبيه: الفينول، الكلوروفورم، والكحول الإيزواميلي هي سامة إذا استنشاق وتآكل. والعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. أيضا، التعامل مع الفينول، الكلوروفورم، ونفايات الكحول الإيزواميلي وفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكرار مرة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع التعديلات التالية: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الغشاء مرتين. بعد غسل الماضي، وترك الأنابيب مفتوحة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتبخير الايثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على شطف، إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O، احتضان في تمبراتو الغرفةإعادة لمدة 1 دقيقة، وتدور الأنابيب لمدة 1 ثانية ل رطب بشكل صحيح الغشاء، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة قبل التنازل عن الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 24 درجة مئوية و ~ 17،900 x ز. </li></ol>

<ol><li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li>
<li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li>
<li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li>
<li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li>
<li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li>
<li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905(2015).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li>
<li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li>
<li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li>
<li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li>
<li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li>
<li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+chromatin+research%3A+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67(2016).</li>
<li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li>
<li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li>
<li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li>
<li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li>
<li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30(2015).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

تشيب هو تقنية صالحة للتحقيق في ما إذا كانت البروتينات أو بتمس لها إثراء في مناطق الجينومية محددة. نتائج فحص رقاقة غالبا ما تكون صعبة للتفسير لأسباب بيولوجية أو فنية. الأسباب البيولوجية كثيرة و تشمل ضعف أو غير مباشر ملزمة من البروتينات إلى الحمض النووي. وهناك أيضا قيود تقنية، مثل خصوصية الأجسام المضادة محدودة وتحلل الخلايا غير فعالة أو القص الكروماتين. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها ( الجدول 5 ) يمكن أن تساعد القارئ على حل المشاكل التي قد تواجهها مع المقايسات رقاقة. هذا البروتوكول، والاستفادة من جهاز أولتراسونيكاتور تركز التبريد، يسمح واحد لكفاءة القص لونين من ناضجة الماوس T- خط الخلية. وتتمثل الخطوة الحاسمة الرئيسية للبروتوكول من قبل القص من لونين، والتي يجب دائما أن يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا. ويقترح لتغيير عدد الخلايا وعدد دورات سونيكيشن. وعلاوة على ذلك، وقالت انها<html> أرينغ الكفاءة يتأثر سلبا وجود سدز يترسب في العينات، والتي قد تشكل خلال تحلل الخلايا على الجليد مع سدز تحلل العازلة. في هذه الحالة، فمن الأفضل لاحتضان العينة بعد تحلل في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق للحد من وجود رواسب سدز. فمن المستحسن لتحسين البروتوكول للحصول على شظايا مقطوعة بين 200 و 500 نقطة في البوصة وتقييم دائما جودة القص من العينات قبل الشروع في مناعي. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون الأمثل الوقت التثبيت، وكمية من الأجسام المضادة و / أو الخلايا، وظروف الغسيل الأمثل لكل الأجسام المضادة. خطوة واحدة أكثر أهمية في اتخاذ إجراء رقاقة ناجحة هو اختيار الأجسام المضادة، والأجسام المضادة منخفضة النوعية تقلل بشكل كبير من كفاءة إمونوبريسيانتاتيون. سابقا، يسمح إجراء اختبار الجودة موحدة لتقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة في السوق<html> سس = &quot;كريف&quot;&gt; 19. واستند خط أنابيب الفرز على لطخة نقطة، وصمة عار الغربية، و تشيب، وتوفير قائمة من الكواشف عالية الجودة مناسبة ل تشيب 19 . في الآونة الأخيرة، تم تقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا باستخدام عالية الكثافة هيستون الببتيد ميكروأري منصات، مما يسمح لإنشاء قاعدة بيانات حول خصوصية الأجسام المضادة 20 . يمكن للقارئ استخدام هذه الأداة المفيدة لتحديد الأجسام المضادة الأكثر تحديدا التي يمكن استخدامها لتجارب رقاقة. لم يتم اختبار هذا البروتوكول لخلايا T الأولية، وفي هذه الحالة، يجب على القارئ الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة الأخرى التي تؤدي بنجاح رقاقة على خلايا T الأولية 3 ، 4 ، 21 . ومن الجدير بالذكر، وقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لأداء رقاقة على السلف الفأر خط T- الخلية، وكذلك على خط الخلايا البطانية الماوس. ove_content &quot;&gt; 5 × 10 6 خلايا ينبغي أن تستخدم لكل مناعي لتحليل علامات هيستون لأن هذا البروتوكول يمكن أيضا أن تكون مناسبة، مع بعض التحسين، لأداء رقاقة على تفس أو العوامل المساعدة، فمن الأفضل لزيادة عدد الخلايا المستخدمة في إمونوبريسيانتاتيون في هذه الحالات.من أجل الوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا لكل تجربة، يمكن تجميع أكثر أليكوتس من المحللة المقطوعة معا قبل تمييع لونين في المخزن المؤقت التخفيف. ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول لأداء رقاقة على البروتينات الذاتية التي لا ترتبط مباشرة إلى الحمض النووي. في هذه الحالة، قد يكون مطلوبا تثبيت مسبق مع بروسلينكرز البروتين البروتين (على سبيل المثال، ديميثيل أديبيميديت، دما) (انظر الملحق ب لمزيد من المعلومات). كان أداء ناجح من رقاقة على العوامل المساعدة سابقا من خلال أوفيركسريسينغ البروتينات التي تنصهر إلى علامة البيوتين. في هذه الحالة، تم تنقية البروتين مع ستريبتافيدين-كونجوغاتيد الخرز المغناطيسي، و قبل تثبيت مع دما تم تنفيذ 22 .

تعتمد التنمية والتمايز والتوازن على برامج التعبير الجيني محددة التي يتم إنشاؤها من خلال إشارات الأحداث التي تعدل بنية الكروماتين، وبالتالي تحديد ما إذا كان يتم تنشيط جين معين أو قمعها بطريقة الخلية والوقت المحدد. خلال تطوير الخلايا التائية، يجب إنشاء برامج التعبير الجيني محددة لتحديد نضوج السلائف خلية T من السلبي المزدوج (دن) إلى حالة إيجابية واحدة (سب)، يمر عبر عدة مراحل وسيطة 1 . كيف تم تنظيم برنامج التعبير الجيني ديناميكيا خلال تطوير الخلايا التائية تم التحقيق على نطاق واسع في السنوات السابقة من قبل العديد من المختبرات 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . عن طريق التعديلات بعد متعدية (بتمس) من الهيستونات، وتبادلهيستونيس الكنسي مع المتغيرات هيستون، الطرد نوكلأوسوم، ومثيلة الحمض النووي تنظم التبديل أون / أوف من الجينات. وقد حققت عدة مجموعات في توزيع الجينوم على نطاق واسع من بتمس والمتغيرات هيستون لتحديد العلامات التي ترتبط مع مختلف دول الكروماتين في كل من المناطق التنظيمية القريبة والبعيدة 7 ، 8 ، 9 ، 10 . تشوير الشلالات تنظيم تنظيم كروماتين الديناميكي عن طريق تبادل الإيجابية والسلبية إنزيمات تعديل الكروماتين (المعروف أيضا باسم معدلات الكروماتين) في عناصر محسن محددة. هذه المعدلات لونين تنظيم هيكل الكروماتين، وبالتالي الناتج النسخي من قبل، على سبيل المثال، مثيلة هيستون الديناميكي والأستيلاتيون. هذا هو الحال في مسار إشارات الشق 11 ، 12 ، 13 ،14 - ديناميكية هيستون بتمس. التبادلات مع المتغيرات هيستون. وإمكانية الإشغال الديناميكي للهيستونات، عوامل النسخ، والعوامل المساعدة يمكن التحقيق من قبل المقايسات المناعية (رقاقة) لونين. وتستخدم الأجسام المضادة محددة للغاية لتنقية المجمعات الحمض النووي البروتين محددة، ويتم تحليل الحمض النووي المنقى عن طريق ير الكمية (قر). تسلسل عميق (تشيب-سيق)؛ أو أقل تواترا في الوقت الحاضر، التهجين ل ميكروأري (رقاقة رقاقة). مقايسات رقاقة في بعض الأحيان تحديا بسبب المضاعفات مع تحلل الخلايا، القص من لونين، و / أو خصوصية منخفضة من الأجسام المضادة. وقد اعتمدت عدة استراتيجيات لتحسين البروتوكول، كما هو الحال بالنسبة إلى نيكسون 15 . استخدام التبريد سونيكاتورس حمام المياه يتجنب عينة التدفئة التي قد تلحق الضرر الحواتم الموجودة على البروتين قيد التحقيق، ولكن الطاقة المطلوبة لقص العينات يحصل فرقت في الماء.تم إجراء تحسين آخر مع تطوير أجهزة أولتراسونيكاتيون تركز التي تمنع تشتت الطاقة. ولذلك، تركز أجهزة أولتراسونيكاتور تسمح للتحسينات في تحلل الخلايا والكروماتين القص، والقضاء على الاختلافات التي يسببها المشغل وزيادة كبيرة في استنساخه. يصف هذا العمل بروتوكول (نظرة عامة التخطيطي في الشكل 1 ) لأداء بكفاءة رقاقة من البروتينات هيستون في خط ناضج الفأر T- دعا E2-10HA 16 ، 17 . الخلايا التائية عادة ما تكون صعبة ل ليس، وقد تم الكشف عن القص من الكروماتين لتكون غير فعالة. في هذا البروتوكول، مما يجعل من استخدام أولتراسونيكاتور تركز على التبريد، تم تحسين عدد الخلايا، العازلة تحلل، ووضع القص ل E2-10HA الماوس خط الخلايا T. يسمح هذا البروتوكول واحد لأداء رقاقة مع استنساخ عالية وفي وقت معقول. في الواقع، فإنه ريكيرإس ما يقرب من يومين لقص الكروماتين وتقييم نوعية القص، وثلاثة أيام لأداء المناعي، عكس الارتباط، وتنقية الحمض النووي.

<table><tbody><tr><td>كواشف Agilent عالية الحساسية D5000</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل أديبيميد (DMA) حراري</td><td> فيشر Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني (FBS)</td> <td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>الفورمالديهايد (FMA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>محلول الأنسولين البشري &nbsp ؛</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr> وسيط <tr><td>Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM)</td> <td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية المتوسطة غير الأساسية (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>البيبتون بريماتون</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>جل قفل المرحلة الثقيل 2 & nbsp ؛ مل</td><td>5 برايم</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>الفينول / الكلوروفورم / كحول الأيزواميل (25:24: 1)</td> <td>روث</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)</td> <td>جيبكو</td><td>14190-094</td><td></td></tr> محلول <tr><td>البروتيناز K (20 مجم / مل) ،</td> طقم تنقية <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR بدرجة الحمض النووي الريبي (RNA) (250)</td> <td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>كيوبت 3.0 مقياس الفلور</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب فحص كيوبيت</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>كيوبيت dsDNA HS الفحص كيت</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A و DNase وخالية من البروتياز (10 &nbsp; ملغ / مل)</td> <td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب AFA الألياف & كاب</td><td>كوفاريس</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا t- خطوط

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

وتقوم مسارات التشوير بتنظيم برامج التعبير الجيني من خلال تشكيل بنية الكروماتين على مستويات مختلفة، مثل التعديلات بعد متعدية (تي تي أم) لتيول هيستون، وتبادل الهيستونات المتعارف عليها مع المتغيرات هيستون، وإخلاء النيوكليوسومات. يتطلب هذا التنظيم ملزمة لعوامل النسخ الحساسة للاشارات (تفس) التي تجنيد الانزيمات تعديل الكروماتين في العناصر التنظيمية التي تعرف بأنها المعززات. فهم كيفية تنظيم شلالات تنظيم نشاط محسن يتطلب تحليل شامل لربط تفس، الكروماتين تعديل الإنزيمات، وإشغال علامات هيستون محددة والمتغيرات هيستون. المقايسات المناعية (رقاقة) الكروماتين استخدام أجسام مضادة محددة للغاية ل إيمونوبريسيبيتات بروتين معين / المجمعات دنا. تحليل لاحق من الحمض النووي المنقى يسمح لتحديد المنطقة المحتلة من قبل البروتين المعترف بها من قبل الأجسام المضادة. يصف هذا العمل بروتوكول ل بي كفاءةتشوه، بسبب، هيستون، بروتينز، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، إنضج، الفأر، T-سيل، سطر. بروتوكول عرض يسمح لأداء المقايسات رقاقة في إطار زمني معقول ومع استنساخ عالية.

يصف هذا العمل بروتوكول ل لونين إمونوبريسيانتاتيون (رقاقة) باستخدام ناضجة الماوس T- خط الخلية. هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق في توزيع علامات هيستون محددة في مواقع المروج محددة أو الجينوم واسعة.

كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إجراء الترسيب المناعي للكروماتين بكفاءة في خطوط خلايا T الفأرية مع قابلية عالية للتكرار وفي وقت معقول لدراسة توزيع علامات الهستون في مناطق جينومية محددة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الكروماتين مع تركيز خاص على خلايا T، مثل كيفية تنظيم بنية الكروماتين أثناء انقسام خلايا T أو تنشيطها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن تكسير الكروماتين يتم بكفاءة وقابلية عالية للتكرار.يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن ظروف تكسير الكروماتين يصعب تحديدها، كما أن خطوات الفينول-كلوروفورم وكحول الإيزواميل قد تكون صعبة. ستقوم فرانشيسكا فيرانتي، طالبة الدكتوراه في مختبرنا، بشرح الإجراء. في اليوم الأول، يتم نقل الخلايا التائية للفئران من طبق ذو ستة آبار إلى أنبوب سعة 50 milliliter.بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 24 degrees celsius وبقوة تقريبية تبلغ 271 ×g. وبعد إعادة تعليق كتلة الخلايا في 30 milliliters من وسط زراعة الخلايا IMDM، قم بعد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer. اجمع حصصاً مكونة من 20 مليون خلية في أنابيب جديدة سعة 50 milliliter. ثم أضف الفورمالدهيد بتركيز نهائي 1% مباشرة إلى وسط زراعة الخلايا واتركه في الحاضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.بعد ذلك، أضف حجماً يعادل 1/8 من glycine بتركيز one molar وpH 7.5، ثم حضّن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 24 degrees celsius وبقوة 271 times G تقريباً. ثم اغسل الخلايا بإعادة تعليق الراسب الخلوي في 10 milliliters من phosphate buffered saline وتكرار عملية الطرد المركزي. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام one milliliter من PBS.نقل الخلايا المعاد تعليقها إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر قبل عملية الطرد المركزي. يعد تكسير الكروماتين الخطوة الأكثر أهمية حيث يعتمد على عدد الخلايا، وأنابيب التكسير، والجهاز المستخدم، ومحلول التحلل، بالإضافة إلى معاملات التكسير. بعد عملية الغسل، أعد تعليق كتلة الخلايا في 1 ملليلتر من محلول SGS lysis buffer وحضنها على الثلج.بعد مرور 10 دقائق، انقل كل عينة إلى أنبوب سونيكة (sonication tube). ثم قم بإجراء عملية القص (shearing) باستخدام جهاز سونيكة مركّز (focused-ultrasonicator) وفقاً للإعدادات الموضحة في البروتوكول النصي. بعد عملية القص، انقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 milliliter.قم بإجراء الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C وبقوة تبلغ 18,000 ×g تقريبًا. ثم انقل السائل الطافي إلى أنابيب جديدة. اجمع 50 µL لتحديد كفاءة القص وقم بتجميد المستخلص المَقصوص سريعًا باستخدام النيتروجين السائل. خزّن المستخلص في حصص منفردة للاستخدام عند درجة حرارة -80 °C.لتحديد كفاءة القص، أضف أولاً 50 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) إلى 50 µL من كل محلول تحلل خلوي مقصوص. حضن المزيج عند 65 °C طوال الليل مع الرج. وفي اليوم الثاني، أضف 100 µL من محلول TE المنظم، و 4 µL من Rnase A بتركيز 10 mg/mL إلى العينات.اخلط العينات وحضنها لمدة ساعتين عند 37 °C مع الرج. ثم أضف 2 µL من Proteinase K بتركيز 20 mg/mL إلى كل عينة، قبل التحضين لمدة ساعتين عند 55 °C مع الرج. بعد ذلك، انقل كل عينة إلى أنبوب جل مناسب لاستخلاص الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل.تعامل مع الأنابيب وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 200 µL من phenol chloroform isoamyl alcohol ورج الأنابيب. وبعد عملية الطرد المركزي، انقل الطور العلوي إلى أنابيب جديدة.كرر هذه العملية مرة واحدة. قم بتنقية الـ DNA باستخدام أعمدة التنقية وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، باستثناء غسل الغشاء مرتين. بعد الغسلة الأخيرة، اترك الأنبوب مفتوحًا لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لتبخير الإيثانول المتبقي.لإجراء عملية الشطف، أضف 50 µL من الماء إلى العمود واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بتدوير الأنبوب لمدة ثانية واحدة لترطيب الغشاء بشكل صحيح. اترك الغشاء في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة قبل استخلاص الـ DNA عن طريق الطرد المركزي.قم بقياس كمية الـ DNA المنقى باستخدام مقياس الفلورة (flourometer) باستعمال طقم عالي الحساسية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وأخيراً، قم بتحليل ما يقرب من 500 nanograms من الـ DNA المنقى على هلام أغاروز بتركيز 1.8%، وما يقرب من one nanogram من الـ DNA المنقى على نظام ترحيل كهربائي باستخدام طقم عالي الحساسية.في اليوم الثالث، يتم تخفيف حجم واحد من المستخلص الخلوي الممزق بخمسة أحجام من محلول التخفيف المنظم. يتم إجراء التصفية المسبقة للمستخلص المخفف باستخدام 30 µL لكل ملليلتر من حبيبات الأغاروز من البروتين A لمدة 30 دقيقة مع التدوير في الغرفة الباردة. تُوضع العينات في جهاز الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق بسرعة تقريبية تبلغ 750 ×g. يتم جمع 10% من المستخلص المصفى كعينات مدخلات وتخزينها عند درجة حرارة 4 °C.بعد ذلك، قم بتقسيم الكمية المطلوبة من المستخلص الرائق إلى أنابيب جديدة. ثم أضف الأجسام المضادة المختارة إلى كل أنبوب وقم بتدويرها طوال الليل عند 4 °C. وفي اليوم الرابع، أضف 40 µL من حبيبات Protein A.قم بحضن الخليط لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير. اغسل الحبيبات باستخدام 1 mL من المنظم منخفض الملوحة عن طريق الحضن لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير. ثم قم بالطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 4 °C وبقوة تبلغ تقريباً 950 ×g. كرر عملية الغسل باستخدام المنظم عالي الملوحة، ومنظم كلوريد الليثيوم، ومنظم TE.ثم أضف 110 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) إلى العينات. احضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع رج العينات بواسطة جهاز الفورتكس (vortexing) كل دقيقتين. بعد الطرد المركزي مرة أخرى، انقل 100 µL من السائل الطافي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL.كرر عملية الاسترداد باستخدام 100 µL من محلول الاسترداد المنظم واجمع النواتج المستردة. وفي هذه الأثناء، أضف محلول الاسترداد المنظم إلى عينات المدخلات التي تم جمعها مسبقاً للوصول إلى حجم نهائي قدره 200 µL. قم بحضن جميع العينات طوال الليل عند 65 °C مع الرج.في اليوم الخامس، أضف 200 µL من منظم TE إلى كل ناتج استخلاص و8 µL من Rnase A بتركيز 10 mg/mL. اخلط العينات قبل تحضينها لمدة ساعتين عند 37 °C مع الرج. بعد ذلك، أضف 4 µL من proteinase K بتركيز 20 mg/mL إلى كل ناتج استخلاص قبل التحضين لمدة ساعتين عند 55 °C مع الرج. ثم انقل كل عينة إلى أنبوب هلام مناسب لاستخلاص الفينول والكلوروفورم وكحول الإيزواميل.أضف 400 µL من الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل ورُج الأنابيب. وبعد طرد الأنابيب مركزياً، انقل الطور العلوي إلى أنابيب جديدة وكرر هذه العملية مرة واحدة. وأخيراً، قم بتنقية الـ DNA باستخدام أعمدة التنقية كما سبق.تظهر هذه النتيجة التمثيلية لعملية قص خطوط الخلايا التائية للفئران تفتيتاً فعالاً للكروماتين. يظهر هنا تجربة تمثيلية لترسيب الكروماتين مناعياً في خطوط الخلايا التائية للفئران. حيث يظهر المحفز للجين التدبيري glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase إثراءً عالياً لثلاثي ميثيلة الليسين 4 على الهيستون 3.وأسيتلة الليسين 27 على الهيستون 3. ولكن ليس بالنسبة لأحادي ميثيل الليسين 4 على الهيستون 3. وعلى العكس من ذلك، فإن المعزز للجين غير النشط deltex-1 يكون غنياً جداً بأحادي ميثيل الليسين 4 على الهيستون 3.لكنها كانت فقيرة في الإثراء لعملية ثلاثي ميثيل اللايسين الرابع في الهيستون الثالث، وأستلة اللايسين 27 في الهيستون الثالث. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إذابة رواسب SGS قبل عملية قص العينات.لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة أثناء دراسة التنظيم الجيني في الخلايا التائية. وقد اخترنا الخلايا التائية لأنها ذات صلة وثيقة بالتطبيقات الطبية، وتمثل أحد أفضل الأنظمة النموذجية الموصوفة لدراسة التعبير الجيني في حقيقيات النوى العليا. وبعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الكروماتين لاستكشاف تنظيم الكروماتين في الأنظمة الثديية.تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج الأمراض المرتبطة بالخلايا التائية، لأنها تسمح بتحليل كيفية إنشاء وتنظيم برامج التعبير الجيني في الخلايا التائية. لا تنسَ أن التعامل مع الفورمالدهيد، والفينول كلوروفورم، وكحول إيزوأميل يعد أمراً بالغ الخطورة، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل العمل تحت غطاء fume hood وارتداء معدات الوقاية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تنظيم الكروماتين في الخلايا التائية للفئران، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل خطوط الخلايا البطانية والرئوية.

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

نحن يبرهن على وجود مناعي لونين (CHIP) طريقة لتحديد التفاعلات عامل في جينات محددة الأنسجة أثناء أو بعد ظهور الأنسجة محددة التعبير الجيني في الأنسجة الجنينية الماوس. هذا ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع بروتوكول لدراسة تفعيل الجين الأنسجة محددة كما يحدث أثناء التطور الجنيني الطبيعي.

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

يصف هذا الفيديو بروتوكول اختبار الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ، وهي تقنية كلاسيكية لإثبات تفاعلات البروتين والحمض النووي. تستخدم هذه التقنية لتحديد الجينات المستهدفة في خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن البشري.

مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين: تقنية لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي في الخلايا

نحن تصف طريقة قوية لونين مناعي باستخدام خلايا T الأولية. تأسست هذه الطريقة على النهج القياسية، ولكن يستخدم مجموعة محددة من الظروف والكواشف التي تعمل على تحسين كفاءة لكميات محدودة من الخلايا. الأهم من ذلك، يتم تقديم وصفا مفصلا لمرحلة تحليل البيانات.

مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية

هنا نصف مقايسة قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC-MS / MS) لتحديد كمية مثبط المناعة تاكروليموس في بقع الدم المجففة باستخدام خطوة ترسيب يدوية بسيطة للبروتين واستخراج العمود عبر الإنترنت.

الكمي للمناعة tacrolimus على وبقع الدم الجافة عن طريق LC-MS / MS

ويرد بروتوكول رواية تحضيرا للونين من الماوس الكبار الهيكل العظمى والعضلات تتكيف مع دراسة تنظيم الجينات في ألياف العضلات التي إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين.

تحسين بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين من الماوس الهيكل العظمى والعضلات

هنا يمكننا وصف بروتوكول لكفاءة الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) تليها الفائق تسلسل الحمض النووي (الرقائق-seq) من الأنسجة الدهنية براون (BAT) المعزولة من ماوس. هذا البروتوكول مناسبة لكل رسم الخرائط هيستون التعديلات والتعريب على نطاق الجينوم من البروتينات غير هيستون لمصلحة فيفو فيالتحقيق.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للنسيج الدهني البنى موريني

الكروماتين المناعية الترسيب (ChIP) هو أداة قوية لفهم الآليات الجزيئية لتنظيم الجينات. ومع ذلك، فإن الطريقة تنطوي على صعوبات في الحصول على تجزئة الكروماتين القابلة للاستنساخ عن طريق القص الميكانيكي. هنا، نحن نقدم بروتوكول محسن ة لـ ChIP باستخدام الهضم الأنزيمي.

الكروماتين المناعية الترسيب الفحص باستخدام النوكلور اتوcleases Micrococcal في خلايا الثدييات

يفصّل البروتوكول نموذج سرطان المورين في المختبر لاستطالة النسخ المعيبة غير الوراثية. هنا، يستخدم تثبيط المزمن من CDK9 لقمع استطالة الإنتاجية من RNA Pol II على طول الجينات استجابة المؤيدة للالتهابات لتقليد ودراسة ظاهرة TE المفرطة سريريابالتأكيد، موجودة في حوالي 20٪ من جميع أنواع السرطان.

نموذج خط خلية Murine القائم على تثبيط CDK9 المزمن لدراسة عيوب الاستطالة غير الوراثية الواسعة الانتشار (TEبالتأكيد)في السرطانات

يركز هذا البروتوكول على تحضير الكروماتين من الأنسجة المجمدة المفاجئة وهو مناسب لترسب الكروماتين المناعي المتشابك (X-ChIP) متبوعا إما بتحليل PCR الكمي (X-ChIP-qPCR) أو نهج تسلسل الجيل التالي (X-ChIP-seq).

استخراج الكروماتين من أنسجة الكبد الخيمرية المجمدة لتحليل الترسيب المناعي للكروماتين

تعرض الدراسة الحالية بروتوكولات لتقييم الالتزام المبكر بالمصير لخلايا TFH الخاصة بالفيروس والتلاعب بالتعبير الجيني في هذه الخلايا.

الوصول إلى التمايز المبكر للخلية التائية المساعدة المسامية CD4 + الخاصة بالفيروس في الفئران المصابة بفيروس LCMV الحاد

تعلم تقنية كروماتين إمونوبريسيبيتاتشن (ChIP) لدراسة علامات الهيستون في خلايا T الفأرية. هذه الطريقة الفعالة والقابلة للتكرار تساعد الباحثين على فهم تنظيم الكروماتين في الخلايا المناعية.

كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط

استكشف المزيد من الفيديوهات