كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إجراء الترسيب المناعي للكروماتين بكفاءة في خطوط خلايا T الفأرية مع قابلية عالية للتكرار وفي وقت معقول لدراسة توزيع علامات الهستون في مناطق جينومية محددة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الكروماتين مع تركيز خاص على خلايا T، مثل كيفية تنظيم بنية الكروماتين أثناء انقسام خلايا T أو تنشيطها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن تكسير الكروماتين يتم بكفاءة وقابلية عالية للتكرار.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن ظروف تكسير الكروماتين يصعب تحديدها، كما أن خطوات الفينول-كلوروفورم وكحول الإيزواميل قد تكون صعبة. ستقوم فرانشيسكا فيرانتي، طالبة الدكتوراه في مختبرنا، بشرح الإجراء. في اليوم الأول، يتم نقل الخلايا التائية للفئران من طبق ذو ستة آبار إلى أنبوب سعة 50 milliliter.

بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 24 degrees celsius وبقوة تقريبية تبلغ 271 ×g. وبعد إعادة تعليق كتلة الخلايا في 30 milliliters من وسط زراعة الخلايا IMDM، قم بعد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer. اجمع حصصاً مكونة من 20 مليون خلية في أنابيب جديدة سعة 50 milliliter. ثم أضف الفورمالدهيد بتركيز نهائي 1% مباشرة إلى وسط زراعة الخلايا واتركه في الحاضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.

بعد ذلك، أضف حجماً يعادل 1/8 من glycine بتركيز one molar وpH 7.5، ثم حضّن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 24 degrees celsius وبقوة 271 times G تقريباً. ثم اغسل الخلايا بإعادة تعليق الراسب الخلوي في 10 milliliters من phosphate buffered saline وتكرار عملية الطرد المركزي. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام one milliliter من PBS.

نقل الخلايا المعاد تعليقها إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر قبل عملية الطرد المركزي. يعد تكسير الكروماتين الخطوة الأكثر أهمية حيث يعتمد على عدد الخلايا، وأنابيب التكسير، والجهاز المستخدم، ومحلول التحلل، بالإضافة إلى معاملات التكسير. بعد عملية الغسل، أعد تعليق كتلة الخلايا في 1 ملليلتر من محلول SGS lysis buffer وحضنها على الثلج.

بعد مرور 10 دقائق، انقل كل عينة إلى أنبوب سونيكة (sonication tube). ثم قم بإجراء عملية القص (shearing) باستخدام جهاز سونيكة مركّز (focused-ultrasonicator) وفقاً للإعدادات الموضحة في البروتوكول النصي. بعد عملية القص، انقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 milliliter.

قم بإجراء الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C وبقوة تبلغ 18,000 ×g تقريبًا. ثم انقل السائل الطافي إلى أنابيب جديدة. اجمع 50 µL لتحديد كفاءة القص وقم بتجميد المستخلص المَقصوص سريعًا باستخدام النيتروجين السائل. خزّن المستخلص في حصص منفردة للاستخدام عند درجة حرارة -80 °C.

لتحديد كفاءة القص، أضف أولاً 50 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) إلى 50 µL من كل محلول تحلل خلوي مقصوص. حضن المزيج عند 65 °C طوال الليل مع الرج. وفي اليوم الثاني، أضف 100 µL من محلول TE المنظم، و 4 µL من Rnase A بتركيز 10 mg/mL إلى العينات.

اخلط العينات وحضنها لمدة ساعتين عند 37 °C مع الرج. ثم أضف 2 µL من Proteinase K بتركيز 20 mg/mL إلى كل عينة، قبل التحضين لمدة ساعتين عند 55 °C مع الرج. بعد ذلك، انقل كل عينة إلى أنبوب جل مناسب لاستخلاص الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل.

تعامل مع الأنابيب وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 200 µL من phenol chloroform isoamyl alcohol ورج الأنابيب. وبعد عملية الطرد المركزي، انقل الطور العلوي إلى أنابيب جديدة.

كرر هذه العملية مرة واحدة. قم بتنقية الـ DNA باستخدام أعمدة التنقية وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، باستثناء غسل الغشاء مرتين. بعد الغسلة الأخيرة، اترك الأنبوب مفتوحًا لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لتبخير الإيثانول المتبقي.

لإجراء عملية الشطف، أضف 50 µL من الماء إلى العمود واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بتدوير الأنبوب لمدة ثانية واحدة لترطيب الغشاء بشكل صحيح. اترك الغشاء في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة قبل استخلاص الـ DNA عن طريق الطرد المركزي.

قم بقياس كمية الـ DNA المنقى باستخدام مقياس الفلورة (flourometer) باستعمال طقم عالي الحساسية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وأخيراً، قم بتحليل ما يقرب من 500 nanograms من الـ DNA المنقى على هلام أغاروز بتركيز 1.8%، وما يقرب من one nanogram من الـ DNA المنقى على نظام ترحيل كهربائي باستخدام طقم عالي الحساسية.

في اليوم الثالث، يتم تخفيف حجم واحد من المستخلص الخلوي الممزق بخمسة أحجام من محلول التخفيف المنظم. يتم إجراء التصفية المسبقة للمستخلص المخفف باستخدام 30 µL لكل ملليلتر من حبيبات الأغاروز من البروتين A لمدة 30 دقيقة مع التدوير في الغرفة الباردة. تُوضع العينات في جهاز الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق بسرعة تقريبية تبلغ 750 ×g. يتم جمع 10% من المستخلص المصفى كعينات مدخلات وتخزينها عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، قم بتقسيم الكمية المطلوبة من المستخلص الرائق إلى أنابيب جديدة. ثم أضف الأجسام المضادة المختارة إلى كل أنبوب وقم بتدويرها طوال الليل عند 4 °C. وفي اليوم الرابع، أضف 40 µL من حبيبات Protein A.

قم بحضن الخليط لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير. اغسل الحبيبات باستخدام 1 mL من المنظم منخفض الملوحة عن طريق الحضن لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير. ثم قم بالطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 4 °C وبقوة تبلغ تقريباً 950 ×g. كرر عملية الغسل باستخدام المنظم عالي الملوحة، ومنظم كلوريد الليثيوم، ومنظم TE.

ثم أضف 110 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) إلى العينات. احضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع رج العينات بواسطة جهاز الفورتكس (vortexing) كل دقيقتين. بعد الطرد المركزي مرة أخرى، انقل 100 µL من السائل الطافي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL.

كرر عملية الاسترداد باستخدام 100 µL من محلول الاسترداد المنظم واجمع النواتج المستردة. وفي هذه الأثناء، أضف محلول الاسترداد المنظم إلى عينات المدخلات التي تم جمعها مسبقاً للوصول إلى حجم نهائي قدره 200 µL. قم بحضن جميع العينات طوال الليل عند 65 °C مع الرج.

في اليوم الخامس، أضف 200 µL من منظم TE إلى كل ناتج استخلاص و8 µL من Rnase A بتركيز 10 mg/mL. اخلط العينات قبل تحضينها لمدة ساعتين عند 37 °C مع الرج. بعد ذلك، أضف 4 µL من proteinase K بتركيز 20 mg/mL إلى كل ناتج استخلاص قبل التحضين لمدة ساعتين عند 55 °C مع الرج. ثم انقل كل عينة إلى أنبوب هلام مناسب لاستخلاص الفينول والكلوروفورم وكحول الإيزواميل.

أضف 400 µL من الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل ورُج الأنابيب. وبعد طرد الأنابيب مركزياً، انقل الطور العلوي إلى أنابيب جديدة وكرر هذه العملية مرة واحدة. وأخيراً، قم بتنقية الـ DNA باستخدام أعمدة التنقية كما سبق.

تظهر هذه النتيجة التمثيلية لعملية قص خطوط الخلايا التائية للفئران تفتيتاً فعالاً للكروماتين. يظهر هنا تجربة تمثيلية لترسيب الكروماتين مناعياً في خطوط الخلايا التائية للفئران. حيث يظهر المحفز للجين التدبيري glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase إثراءً عالياً لثلاثي ميثيلة الليسين 4 على الهيستون 3.

وأسيتلة الليسين 27 على الهيستون 3. ولكن ليس بالنسبة لأحادي ميثيل الليسين 4 على الهيستون 3. وعلى العكس من ذلك، فإن المعزز للجين غير النشط deltex-1 يكون غنياً جداً بأحادي ميثيل الليسين 4 على الهيستون 3.

لكنها كانت فقيرة في الإثراء لعملية ثلاثي ميثيل اللايسين الرابع في الهيستون الثالث، وأستلة اللايسين 27 في الهيستون الثالث. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إذابة رواسب SGS قبل عملية قص العينات.

لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة أثناء دراسة التنظيم الجيني في الخلايا التائية. وقد اخترنا الخلايا التائية لأنها ذات صلة وثيقة بالتطبيقات الطبية، وتمثل أحد أفضل الأنظمة النموذجية الموصوفة لدراسة التعبير الجيني في حقيقيات النوى العليا. وبعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الكروماتين لاستكشاف تنظيم الكروماتين في الأنظمة الثديية.

تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج الأمراض المرتبطة بالخلايا التائية، لأنها تسمح بتحليل كيفية إنشاء وتنظيم برامج التعبير الجيني في الخلايا التائية. لا تنسَ أن التعامل مع الفورمالدهيد، والفينول كلوروفورم، وكحول إيزوأميل يعد أمراً بالغ الخطورة، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل العمل تحت غطاء fume hood وارتداء معدات الوقاية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تنظيم الكروماتين في الخلايا التائية للفئران، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل خطوط الخلايا البطانية والرئوية.