ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مواقع دمج الناقلات الفيروسية القهقرية المشتقة من فيروس لوكيميا الفأر (murine leukemia virus) لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلايا. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في دراسات العلاج الجيني وتنظيم الجينات، مثل تحديد موقع دمج الناقل في الجينوم البشري وأي العناصر التنظيمية يمكن استخدامها بنشاط عبر نوع فرعي معين. لقد جاءت فكرة هذه الطريقة أولاً من خلال ملاحظة أن ناقلات MLV تندمج في المحفزات والمعززات النشطة الخاصة بأنواع فرعية معينة في دراسات العلاج الجيني.

ابدأ بنقل ناقل فيروسي قهقري مشتق من MLV يحمل جين المراسل EGFP ومزود بنمط كاذب من VSV-G أو البروتين السكري الغلافي amphrotopic إلى الخلايا المستهدفة. تُستخدم الخلايا التي خضعت لنقل وهمي (Mock transduced) كعنصر تحكم سلبي. وبعد 48 ساعة من عملية النقل، قم بطرد العينات مركزياً ثم أعد تعليق 100,000 خلية في 300 µL من PBS يحتوي على 2% من مصل الجنين البقري.

بعد ذلك، يتم قياس تعبير EGFP عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. يتم حصاد ما بين 0.5 إلى 5 ملايين خلية أخرى من الخلايا المنقولة لتحضير الحمض النووي الجينومي (gDNA) وإجراء هضم لاحق بواسطة إنزيمات التقييد. يتم إعداد أربعة تفاعلات هضم بإنزيمات التقييد لكل عينة في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر.

قم بهضم 0.1 إلى 1 µg من G-DNA في كل أنبوب، وذلك بإضافة 10 units من TRU91 و1 µL من buffer M لكل عينة في حجم نهائي قدره 10 µL. وزع 2 µL من الخليط في أنابيب الهضم.

ثم يتم تحضين التفاعلات عند 65 °C لمدة ست ساعات أو طوال الليل. وبعد التحضين، أضف 40 µL من الماء إلى أنبوب سعة 1.5 mL. وفي الأنبوب نفسه، أضف 10 units من PST1 و 1 µL من buffer H لكل عينة.

قم بتوزيع 10 µL من خليط تفاعل الهضم في أنابيب الهضم. حضن التفاعلات عند 37 °C لمدة ست ساعات أو طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بتجهيز ثمانية تفاعلات لربط الوصلات في أنابيب سعة 1.5 mL.

لكل تفاعل، أضف خليط تفاعل الربط (ligase) إلى 10 µL من الحمض النووي الجينومي المهضوم. يتم التحضين عند 16 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى ست ساعات. بالنسبة لجولة PCR الأولى، قم بتجهيز 48 تفاعلاً من PCR في أنابيب سعة 0.2 mL.

لكل تفاعل PCR، أضف خليط التفاعل الذي يحتوي على بادئ الربط (linker primer) وبادئ MLV3 prime LTR إلى ميكرولترين من تفاعل الربط. ضع العينات في جهاز التدوير الحراري المزود بغطاء تسخين. اضبط معاملات التدوير وقم بتشغيل الجولة الأولى من تفاعل PCR.

لإجراء الجولة الثانية من تفاعل PCR، جهّز خليط التفاعل الذي يتضمن البادئ المتداخل للرابط (linker nested primer) والبادئ المتداخل لـ MLV3 prime LTR. بعد ذلك، أضف 2 µL من ناتج تفاعل PCR من الجولة الأولى كقالب. ثم، ابدأ تفاعل PCR للجولة الثانية لإنتاج نواتج LN PCR النهائية.

بعد جولة PCR الثانية، اجمع تفاعلات LM PCR المتداخلة الـ 48 في أنبوبة سعة 15 milliliter. ثم أضف 20 microliters من منظم التحميل (loading buffer) إلى 100 microliters من منتج LM PCR المجمع والمرسب. ثم قم بتحميل العينة على هلام أغاروز بتركيز 1% مع سلم DNA بوزن 100 base pair.

قم بتشغيل الهلام بجهد خمسة فولت لكل سنتيمتر لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة، وبمجرد انفصال الحزم، اقطع جزء الهلام الذي يحتوي على مضخمات يتراوح طولها بين 500 إلى 150 زوج قاعدي. بعد تنقية ناتج LM PCR باستخدام طقم استخلاص الهلام القائم على الأعمدة، قم بقياس التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية قبل الانتقال إلى تحضير المكتبة. كما يجب تقييم طول نواتج LM PCR باستخدام جهاز bioanalyzer وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة.

قم بتجهيز المكتبة عن طريق إعداد تفاعل PCR للفهرسة. لكل تفاعل PCR، استخدم من 150 إلى 170 nanograms من ناتج LM PCR المنقى، مع استخدام تركيبات فهرسة مختلفة لكل عينة. قم بإجراء تفاعل PCR في جهاز دورات حرارية مزود بغطاء مسخن وفقاً للإرشادات.

بعد إجراء تفاعل PCR، قم بتخفيف المكتبة المنقاة إلى 10 nanomolar باستخدام tris HCL بتركيز 10 millimolar. بعد ذلك، اخلط خمسة µL من المجمع المخفف مع خمسة µL من sodium hydroxide بتركيز 0.2 N في أنبوب جديد سعة 1.5 mL. قم بالرج في جهاز vortex لفترة وجيزة، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لترسيب السائل، وبعد ذلك قم بالتحضين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتمسخ المكتبات.

ضع أنابيب المزيج المنزوع طبيعته (denatured pool) على الثلج وأضف 990 µL من منظم التهجين HT1 المبرد مسبقاً. بعد ذلك، قم بنقل 300 µL من المزيج المنزوع طبيعته إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL. وأضف 300 µL من منظم HT1 المبرد مسبقاً للحصول على تركيز نهائي للمزيج المكتبي يبلغ 10 pM.

وبالتوازي، اخلط 10 nanomolar من مكتبة التحكم الثابتة في حجم 2 µL مع 3 µL من 10 millimolar tris HCl في أنبوب سعة 1.5 mL. أضف 5 µL من 0.2 N sodium hydroxide وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس لفترة وجيزة. بعد عملية الترسيب بالطرد المركزي، حضن المزيج لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لمسخ المادة المثبتة المخففة.

بعد فترة الحضانة، ضع الأنبوب على الثلج وأضف 990 µL من محلول HT1 المبرد مسبقاً. الآن، انقل 100 µL من المثبت المنزع الطبيعة (denatured fix) إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL وأضف 300 µL من محلول HT1 المبرد مسبقاً للحصول على تركيز نهائي قدره 10 pM من المثبت. أخيراً، في أنبوب جديد سعة 1.5 mL، اخلط 510 µL من تجمع المكتبة المنزع الطبيعة (denatured library pool) مع 90 µL من المكتبة المثبتة المنزوعة الطبيعة، وبذلك يتم الحصول على تجمع نهائي بتركيز 10 pM يحتوي على 15% من تحكم المثبت (fix control) لغرض التسلسل.

توضح هذه الصورة تحليل 3498 و2989 و4103 عنقوداً من مواقع دمج MLV المتكررة في الخلايا الجذعية المكونة للدم، والأسلاف الحمراء، والأسلاف النقوية على التوالي. وفي كل مجتمع خلوي، تداخلت أكثر من 95% من عناقيد MLV مع المعززات والمحفزات المحددة فوق جينياً. وكانت المناطق المستهدفة بـ MLV والخاصة بكل خلية ذات أسيلة عالية ومرتبطة بالتعبير الخاص بالخلية للجين المستهدف.

تشمل الأمثلة محفز جين SPINK2 النوعي لخلايا HSP. ومنطقة التحكم في الموضع التي تحتوي على معززات قوية لجينات غلوبين بيتا الشبيهة النوعية للخلايا المكونة للدم. والمعززات الموجودة في المنبع من جين LYZ النوعي لخلايا NPP.

أثبتت مقايسات لوسيفيريز المراسلة (Luciferase reporter assays) صحة مجموعة فرعية من المعززات المستهدفة بـ MLV والخاصة بخلايا معينة في كل من سلائف erythroid-progenitor (EPP) وسلائف multipotent-progenitor (MPP). وقد أظهرت المناطق المستهدفة بـ MLV والخاصة بسلسلة الخلايا الحمراء نشاطاً أعلى في EPP مقارنة بـ MPP والعكس صحيح، مما يؤكد أن MLV يحدد المعززات الخاصة بالخلايا والتي قد تتحكم في تعبير الجينات المجاورة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون أسبوع واحد إذا نُفذت بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر زيادة وتيرة الخلايا التي تم تحويلها (transduced cells) إلى أقصى حد لضمان استرجاع أمثل لمواقع التكامل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية رسم خرائط مواقع التكامل الفيروسي من خلال ضبط الحمض النووي الجينومي (genomic DNA) أولاً، ثم ربط القطع الجينومية بوصلة حمض نووي (DNA linker)، يليه تضخيم الوصلة الفيروسية للجينوم المضيف عبر تقنية LM PCR، وأخيراً إجراء تسلسل عميق (deep sequencing) لمكتبة النواتج المضخمة (amplicon library).