ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو رسم خريطة لمواقع التكامل لنواقل الفيروسات القهقرية المشتقة من فيروس ابيضاض الدم الفئراني لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في دراسات العلاج الجيني وتنظيم الجينات مثل مكان تكامل الناقل في الجينوم البشري والعنصر التنظيمي الذي يمكن استخدامه بنشاط عبر نوع فرعي معين. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة مع ملاحظة أنه في دراسات العلاج الجيني ، تندمج نواقل MLV في محفزات ومعززات فرعية نشطة.

ابدأ بتحويل الخلايا المستهدفة بناقل فيروسي قهقري مشتق من MLV يؤوي جين مراسل EGFP والتنطيب الكاذب باستخدام VSV-G أو البروتين السكري للغلاف البرمائي. تستخدم الخلايا المحولة الوهمية كعنصر تحكم سلبي. بعد 48 ساعة من التنبيغ ، قم بالطرد المركزي للعينات ثم أعد تعليق 100،000 خلية في 300 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على 2 في المائة من مصل الأبقار الجنينية.

ثم قم بقياس تعبير EGFP عن طريق التحليل المتري لموقع التدفق. احصد 0.5 إلى خمسة ملايين خلية أخرى منقولة لتحضير الحمض النووي الجيني وهضم إنزيم التقييد اللاحق. قم بإعداد أربعة عمليات هضم إنزيم تقييد لكل عينة في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر.

هضم 0.1 إلى ميكروغرام واحد من G-DNA في كل أنبوب. عن طريق إضافة 10 وحدات من TRU91 وميكرولتر واحد من المخزن المؤقت M لكل عينة في حجم نهائي قدره 10 ميكرولتر. قم بتوزيع ميكرولترين من المزيج في أنابيب الهضم.

ثم احتضان التفاعلات عند 65 درجة مئوية لمدة ست ساعات أو بين عشية وضحاها. بعد الحضانة ، أضف 40 ميكرولترا من الماء إلى أنبوب سعة 1.5 مل. في نفس الأنبوب، أضف 10 وحدات من PST1 وميكرولتر واحد من المخزن المؤقت H لكل عينة.

قم بتوزيع 10 ميكرولتر من مزيج تفاعل الهضم في أنابيب الهضم. احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات أو بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإعداد ثمانية تفاعلات ربط الرابط في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر.

لكل تفاعل ، أضف خليط تفاعل الليغاز إلى 10 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني للهضم. احتضن عند 16 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى ست ساعات. بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الجولة الأولى ، قم بإعداد 48 تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنابيب 0.2 ملليلتر.

لكل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف خليط التفاعل الذي يحتوي على برايمر الرابط وبرايمر MLV3 الأساسي LTR إلى ميكرولترين من تفاعل الربط. ضع العينات في جهاز تدوير حراري بغطاء سخان. قم بتعيين معلمات ركوب الدراجات وقم بتشغيل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجولة الأولى.

بالنسبة للجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد خليط التفاعل بما في ذلك التمهيدي المتداخل للرابط والبرايمر المتداخل MLV3 Prime LTR. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من منتج PCR من الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل كقالب. بعد ذلك ، قم بتشغيل تفاعل PCR الجولة الثانية لإنشاء منتجات LN PCR النهائية.

بعد الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اسحب تفاعلات LM PCR المتداخلة 48 في أنبوب سعة 15 ملليلترا. ثم أضف 20 ميكرولترا من مخزن التحميل إلى 100 ميكرولتر من منتج LM PCR المجمع والمترسب. وقم بتحميل العينة على هلام الاغاروز بنسبة واحد بالمائة مع سلم الحمض النووي المكون من 100 زوج أساسي.

قم بتشغيل الجل بقوة خمسة فولت لكل سنتيمتر لمدة 30 إلى 60 دقيقة بمجرد حل العصابات ، وقم بقص نسبة الجل الذي يحتوي على 500 إلى 150 مكبرات صوت طويلة من زوج القاعدة. بعد تنقية منتج LM PCR باستخدام مجموعة استخراج الجل القائمة على العمود ، قم بقياس التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية قبل الشروع في إعداد المكتبة. أيضا ، قم بتقييم طول منتجات LM PCR باستخدام أداة محلل حيوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بإعداد المكتبة عن طريق إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للفهرسة. لكل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم 150 إلى 170 نانوغراما من منتج LM PCR المنقى ، في تركيبة فهرس مختلفة لكل عينة. قم بإجراء PCR في جهاز تدوير حراري بغطاء ساخن كما هو موضح.

بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتخفيف المكتبة المنقاة إلى 10 نانومولار مع 10 مللي مولار تريس هيدروكلوريد. بعد ذلك ، امزج خمسة ميكرولترات من حوض السباحة المخفف مع خمسة ميكرولتر من 0.2 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. دوامة لفترة وجيزة ، قم بالدوران ثم احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتشويه طبيعة المكتبات.

ضع أنابيب المسبح المشوهة على الجليد و 990 ميكرولتر من مخزن التهجين HT1 المبرد مسبقا. ثم قم بنقل 300 ميكرولتر من حمام السباحة المشوه في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. وأضف 300 ميكرولتر من HT1 المبرد مسبقا للحصول على تجمع مكتبة نهائي بعشرة بيكومول.

في موازاة ذلك ، امزج 10 نانومولار من مكتبة التحكم الثابتة في حجم اثنين من الميكرولتر مع 3 ميكرولتر من 10 ملليمولار تريس حمض الهيدروكلوريك في أنبوب 1.5 ملليلتر. أضف خمسة ميكرولترات من 0.2 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم والدوامة لفترة وجيزة. بعد الدوران لأسفل ، احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتغيير طبيعة الإصلاح المخفف.

بعد الحضانة ، ضع الأنبوب على الثلج وأضف 990 ميكرولتر من HT1 المبرد مسبقا. الآن ، قم بنقل 100 ميكرولتر من الإصلاح المشوه في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وأضف 300 ميكرولتر من HT1 المبرد مسبقا للحصول على تركيز نهائي 10 بيكومولار للإصلاح. أخيرا ، في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، امزج 510 ميكرولتر من مسبح المكتبة المشوهة مع 90 ميكرولترا من المكتبة الثابتة المشوهة ، وبالتالي الحصول على تجمع نهائي 10 بيكوملار مع 15٪ من التحكم في الإصلاح ليتم تسلسله.

توضح هذه الصورة تحليل مجموعات 3498 و 2989 و 4103 من مواقع تكامل MLV المتكررة في الخلايا السلفية الجذعية المكونة للدم وأسلاف الكريات الحمراء وأسلاف النخاع على التوالي. في كل مجموعة من الخلايا ، تداخل أكثر من 95٪ من مجموعات MLV مع معززات ومحفزات محددة جينيا. كانت المناطق المستهدفة MLV الخاصة بالخلية أسيتيتلة للغاية ومرتبطة بالتعبير الخاص بالخلية للجين المستهدف.

ومن الأمثلة على ذلك محفز جين SPINK2 الخاص ب HSP. منطقة التحكم في الموضع التي تحتوي على معززات قوية لجينات الغلوبين الشبيهة ببيتا الخاصة بالكريات الحمريثويد. المعززات الموجودة في المنبع من جين LYZ الخاص ب NPP.

قامت فحوصات مراسل Luciferase بالتحقق من صحة المجموعة الفرعية من معززات MLV المستهدفة الخاصة بالخلية في EPP و MPP. كان للمناطق المستهدفة MLV الخاصة بالكريات الحمراء نشاطا أعلى في EPP مقارنة ب MPP والعكس صحيح ، مما يؤكد أن MLV يحدد معززات خاصة بالخلايا التي ربما تتحكم في التعبير عن الجينات القريبة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في الأسبوع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر زيادة تكرار الخلايا المنقولة إلى أقصى حد من أجل استرجاع موقع التكامل الأمثل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تعيين مواقع التكامل الفيروسي عن طريق ضبط الحمض النووي الجيني أولا ثم ربط الأجزاء الجينومية باستخدام رابط الحمض النووي متبوعا بتضخيم الوصلة الفيروسية للجينوم المضيف عبر LM PCR وأخيرا التسلسل العميق لمكتبة amplicon.