نموذج خلية ثقافة مقاومة الشرايين

الهدف العام من هذه التقنية هو زراعة خلايا البطانية والعضلات الملساء معا في المختبر لإنشاء تقاطعات عضلية ظهارية تحدث في الشرايين المقاومة ذات القطر الصغير. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال القلب والأوعية الدموية مثل توطين البروتين وتنشيط شلالات الإشارات في جدار الشرايين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك على وجه التحديد عزل كسور التوصيل العضلي البطاني والعضلات الملساء ، وهو أمر مستحيل القيام به باستخدام شريان فعلي.

العرض المرئي لتضمين البارافين أمرا بالغ الأهمية بشكل خاص ، حيث قد يكون من الصعب تعلم خطوات التضمين دون رؤية العملية. ابدأ في بناء الزراعة المشتركة لخلايا الأوعية الدموية أو VCCC ، عن طريق رش أطباق وأغطية بتري 150 ملم بمطهر ثم مسحها بمنشفة ورقية أو مناديل خالية من النسالة. ثم رش أطباق بتري بنسبة 70٪ من الإيثانول وضعها في الغطاء حتى تجف في الهواء.

افتح لوحة إدراج المرشح في ظل ظروف معقمة. قم بتغطية الجانب السفلي من المرشحات بمحلول الألياف الأليفة عن طريق سحب ما يصل إلى مليلتر واحد من محلول الألياف من خلال الشقوق الجانبية في قاع اللوحة. تأكد من تغطية النصف السفلي من الفلتر واترك الإدخالات في غطاء المحرك ، مع الحفاظ على غطاء اللوحة.

بعد 30 دقيقة من العلاج بمحلول الألياف ، قم بتفريغ أي محلول زائد دون إزعاج إدخالات المرشح. ثم اقلب اللوحة ، ضع المرشحات في النصف السفلي من طبق بتري النظيف. قم بتربسين قارورة مساحتها 225 سنتيمترا مربعا من خلايا العضلات الملساء بثلاثة ملليلتر من محلول التربسين EDTA الدافئ مسبقا.

بمجرد أن ترفع الخلايا ، أضف تسعة ملليلتر من وسط SMC لتحييد التربسين. انقله إلى أنبوب مخروطي الشكل واخلطه جيدا. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة 10 ميكرولتر على مقياس كثافة الدم لتحديد رقم الخلية.

بعد إجراء عد الخلايا ، ضع بعناية 750 ميكرولتر من معلق الخلية الذي يحتوي على ما يقرب من 75،000 خلية عضلية ملساء على الجانب السفلي من كل مرشح. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم الثاني ، املأ كل بئر من ستة ألواح نظيفة بملليلترين من وسط SMC الطازج الدافئ مسبقا.

قم بإزالة الوسيط من الملحق عن طريق الشفط وانقله إلى لوحة الآبار الستة مع وسيط SMC. أضف ملليلترا واحدا من محلول الجيلاتين البقري 0.5٪ إلى الجانب العلوي من الإدخالات وضعه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بتربسين قارورة مساحتها 225 سنتيمترا مربعا من الخلايا البطانية بثلاثة ملليلتر من محلول التربسين EDTA الدافئ مسبقا.

مع النقر اللطيف على القارورة لرفع الخلايا عن اللوحة. بعد إعادة تعليق الخلايا في وسط EC وإجراء تعداد الخلايا ، قم بإزالة الجيلاتين من الفلتر. ثم ، قم بوضع 360 ، 000 ECs بحجم مليلتر واحد على الجانب العلوي من كل إدراج مرشح.

دع الخلايا تحتضن دون إزعاج عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ابدأ التجزئة ، عن طريق شفط الوسط من ستة ألواح من الإدخالات في غطاء مزرعة الخلية ثم نقلها إلى غرفة باردة على الجليد. في الغرفة الباردة، قم بوضع 10 ميكرولترات من PBS على جانب SMC من الإدخالات.

استخدم رافع الخلايا لكشط SMCs. بعد ذلك ، انقل الخلايا من المكشطة إلى طبق بتري مسمى يحتوي على عازلة للتحلل. بمجرد أن تلمس مكشطة الخلية المخزن المؤقت للتحلل ، لا تسمح لها بلمس مرشح الإدخال حتى يتم مسحها تماما وتجفيفها على مناشف ورقية.

كرر تخريد مرشح SMC مرة أو مرتين أخريين ، لإزالة حطام خلية SMC المتبقي بالكامل. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة 10 ميكرولترات من PBS على جانب الخلية البطانية لمرشح الإدخال. اكشط الخلايا في طبق بتري مصنف بشكل مناسب من عازلة التحلل ، كما هو موضح للتو.

اجمع ملاط الخلية من جانب EC من المرشح باستخدام الماصة وانقله إلى طبق بتري مكتوب عليه بشكل مناسب. كن دقيقا جدا في التخلص من الخلايا من جانبي المرشحات لضمان الحد الأدنى من تلوث الخلايا في جزء الوصلة العضلية البطانية. بعد ذلك ، استخدم المشرط بعناية لقطع المرشحات من الملحق البلاستيكي.

افعل ذلك عن طريق قطع 70 إلى 80٪ منه بعيدا عن البلاستيك واستخدام ملقط لسحب الفلتر تماما من هيكل الإدخال البلاستيكي. وجه كل مرشح إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 50 مليلتر يحتوي على عازلة التحلل. تأكد من أن المرشحات مغمورة في المخزن المؤقت وتظل رطبة.

بعد حصاد جميع الخلايا من المرشحات ، قم بتدوير أنبوب MEJ سعة 50 مليلتر بكامل قوته لمدة 15 ثانية أو حتى يمتزج جيدا. قم بإزالة المرشحات من MEJ المخروطي باستخدام ملقط ، واسحبها على طول الجدران الجانبية للأنبوب لترك أكبر قدر ممكن من البروتينات والسوائل في الأنبوب. بمجرد إزالة جميع المرشحات من الأنبوب المخروطي MEJ ، قم بتدوير سريع في جهاز طرد مركزي لسحب كل السائل والبروتينات إلى قاع الأنبوب.

بعد الدوران ، انقل محتويات أنبوب MEJ وأطباق بتري SMC و EC إلى أنابيب طرد مركزي أصغر منفصلة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند ما يقرب من 16،000 × جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المواد الطافية.

بعد ذلك ، تحلل خلية الفحص لمحتوى البروتين باستخدام مقايسة بيزنكونية. في اليوم الخامس من حضانة VCCC ، أضف 4٪ PFA إلى كل بئر يحتوي على ملحق مرشح مغسول واحتضانه طوال الليل مع الاهتزاز عند أربع درجات مئوية. بعد حوالي 24 ساعة ، انقل الإدخالات إلى 70٪ من الإيثانول لمدة 24 ساعة على الأقل.

قم بمعالجة المرشحات على المدى الطويل على معالج الأنسجة الآلي. بعد التشغيل ، قم بإزالة المرشح من الكاسيت الخاص به باستخدام ملقط لتثبيت الفلتر عند الحافة ثم قم بقص الفلتر إلى نصفين بالمقص. ضع كل من النصفين على طبق بارد واملأ قالب التضمين بالبارافين السائل.

قالب التضمين المملوء لفترة وجيزة جدا في اللوحة الباردة ، ثم قم بتضمين كل نصف من المرشح في قالب التضمين مع الجانب المقطوع لأسفل للتأكد من أن المرشح مقسم من المركز. استخدم الملقط لتثبيت الفلتر في مكانه لمنع النصفين من السقوط في بعضهما البعض حتى يبرد البارافين بدرجة كافية ليقف بمفرده. ثم انقل قالب التضمين إلى طبق بارد حتى يتماسك تماما.

قم بتضمين الملحق الذي تمت تصفيته وتقسيمه في اتجاه رأسي. بعد التقسيم ، يمكن تلطيخ VCCC مناعي للتألق المناعي المستعرض. تظهر صورة المجهر الإلكتروني للنقل المناعي هذه شريانا فأريا مع تعبير عن ألفا غلوبين في MEJ المسمى بخرز ذهبي ، والذي يظهر على شكل نقاط سوداء.

توضح هذه اللطخة الغربية أن مثبط منشط البلازمينوجين يتم إثراؤه في جزء MEJ مقابل كسور EC أو SMC. يشير EC البلاستيكي إلى ECs المزروعة على طبق بلاستيكي لا يشكل MEJ. يكشف التلوين المناعي عن التقسيم الضيق لنموذج VCCC.

المستقبل الأدرينالي ألفا -1 فقط في طبقة خلية العضلات الملساء ، ولا يرى مستقبل براديكينين إلا في طبقة الخلية البطانية. يوجد تلطيخ الأكتين F في جميع أنحاء كلا النوعين من الخلايا في MEJ في المختبر كما هو موضح في السهم الأبيض. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء كل شيء معقما حتى وقت الحصاد ، وقم بطلاء الخلايا بعناية وكشط المرشحات تماما.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل النشاف الغربي أو التألق المناعي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل توطين البروتين أو مستويات التعبير أو التنشيط.