شكلي وطريقة التحليل الخلوي للقمة الفك السفلي مورين

الهدف العام من هذه التجربة هو ملاحظة آثار تحميل الضغط في غضروف لقمة الفك السفلي لدى الفئران باستخدام القياسات المورفومترية في الصور الشعاعية والتحليل النسيجي. ويمكن لهذه المقاييس أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بالتغيرات الهيكلية والخلوية داخل لقمة الفك السفلي للقوارض. وتتمثل الميزة الرئيسية للتقنية الموضحة هنا في إمكانية استخدامها لتحليل حيوانات صغيرة أخرى ذات عظام أو مشاركة في الدراسة.

لهذا البروتوكول، قم بتجهيز الفكوك السفلية للفئران المعزولة والمشرحة للاستخدام. انقل الفكوك إلى نظام كابينة الأشعة السينية في طبق بتري. بعد ذلك، التقط الصور الشعاعية عند 26 kilovolts لمدة خمس ثوانٍ.

الآن، افتح الصور في برنامج التحليل لإجراء القياسات المورفومترية. أولاً، استخدم زر الوحدة لضبط شريط المقياس. بعد ذلك، حدد ست نقاط تشريحية باستخدام نمط العلامة 2.

أولاً، حدد النقاط الأكثر خلفية لللقمة الفكية لتكون النقطة الأولى. بعد ذلك، حدد النتوء القاطعي ليكون النقطة الثانية. ثم حدد أعمق نقطة في الثلم السيني لتكون النقطة الثالثة.

بعد ذلك، حدد أعمق نقطة في تقعر الرأد الفكي السفلي، النقطة أربعة، ثم حدد النقطة الأكثر أمامية في السطح المفصلي لللقمة، النقطة خمسة. الآن، حدد النقطة الأكثر خلفية في السطح المفصلي لللقمة كنقطة سادسة وتابع أخذ قياسات الطول باستخدام أداة قياس الطول. بعد ذلك، استخدم أداة الخط العمودي من النقطتين ثلاث وأربع لقياس طول رأس اللقمة، وهو طول العمود المقام من النقطة واحدة إلى الخط الواصل بين النقطتين ثلاث وأربع.

ثم قم بقياس طول الفك السفلي، بين النقطتين الأولى والثانية. وأخيرًا، قم بقياس عرض رأس اللقمة، والذي يقع بين النقطتين الخامسة والسادسة. ولحفظ البيانات، انسخ قائمة القياسات الموجودة على الجانب الأيمن من الشاشة.

قبل تضمين الفكوك السفلية المثبتة غير منزوعة الكالسيوم، انقعها طوال الليل في محلول سكروز بتركيز 30% في PBS. وفي اليوم التالي، قم باستئصال أي أنسجة رخوة زائدة واقطع لقمة الفك السفلي بعناية. الآن، ضع العينات في قوالب بلاستيكية، بحيث يكون السطح الإنسي لللقمة مواجهاً لقاعدة القالب وتكون العينة موازية لقاع القالب.

بعد ذلك، اغمرها في راتنج التضمين وقم بتبريد الراتنج باستخدام قطعة من الثلج الجاف. تالياً، املأ القوالب حتى الأعلى بمزيد من راتنج التضمين. ثم انقلها إلى مادة two methyl butane الباردة، المبردة بواسطة مجمد أو بواسطة الثلج الجاف.

بمجرد التبريد، تُحفظ العينات عند درجة حرارة -20 °C أو -80 °C تمهيداً لعملية التقطيع. ولتحديد كمية تعبير Col10a1 في مركز الغضروف المرتكز (MCC) للمقاطع السهمية للقالب اللقمي، افتح الصور النسيجية في حزمة برمجيات لتحليل الصور وحدد المنطقة المطلوبة باستخدام أداة التحديد الحر (lasso tool). في هذه الحالة، يتم اختيار منطقة MCC.

دوّن عدد البكسلات في المنطقة، والموضح في مربع المدرج التكراري (histogram). بعد ذلك، حدد البكسلات الحمراء الخاصة بـ Col10a1 عن طريق ضبط نطاق الألوان. استخدم أداة القطارة لاختيار بكسل أحمر من الصورة ثم انقر موافق. بعد ذلك، سجل عدد البكسلات الحمراء في المنطقة، كما هو موضح في مربع المدرج التكراري.

تمثل نسبة البكسلات الحمراء في المنطقة مقدار تعبير Col10a1. الآن، وباستخدام نفس التقنية الأساسية، قم بقياس نشاط TRAP في MCC والعظم تحت الغضروفي. أولاً، حدد الغضروف في مناطق العظم تحت الغضروفي كمناطق للتحليل وسجل إجمالي عدد البكسلات.

بعد ذلك، حدد البكسلات الصفراء الناتجة عن ركيزة ELF97. دون عدد البكسلات الموجبة واحسب كسر البكسلات الموجبة لـ TRAP. والآن، قم بقياس الخلايا الموجبة لـ EDU والمصبوغة تباينياً باللون الأزرق بواسطة DEPI.

مرة أخرى، حدد المنطقة ذات الأهمية ثم قم بقياس عدد البكسلات الزرقاء داخلها. استخدم هذه الطريقة أيضاً لتحديد عدد البكسلات الإيجابية لـ EDU في المنطقة نفسها. وقد أظهرت القياسات المورفومترية للفئران التي خضعت لتحميل ضاغط على المفصل الفكي الصدغي (TMJ) أن التحميل أدى إلى زيادة كبيرة في طول الفك السفلي ورأس اللقمة.

ومع ذلك، لم يؤدِ التحميل إلى تغيير ملحوظ في عرض اللقمة. وقد كشف التحديد الكمي لتوزيع الكولاجين عن زيادة كبيرة في تعبير Col10a1 وفي MCC في لقمات الحيوانات التي خضعت للتحميل. ومن ناحية أخرى، لم يختلف تعبير Col2a1 كثيراً عن مجموعة الضبط.

زادت نشاطات TRAP في المنطقة تحت الغضروفية لللقيمات وفي الفئران التي تعرضت للحمل، وكذلك زاد الانتشار تحت الغضروفي. يشير صبغ EDU إلى عدد الخلايا التكاثرية. وقد تم قياس توزيع البروتيوغليكان في الغضروف المفصلي (MCC) من خلال تقييم المنطقة المصبوغة بصبغة Toluidine blue وخريطة المسافات.

حدثت زيادة ملحوظة في رسم خرائط المسافات في منطقة الغضروف المفصلي (MCC) لللقيمات في المجموعة التي تعرضت للحمل. ومع ذلك، لم يكن هناك فرق إحصائي في مساحة صبغ البروتيوغليكان بين المجموعات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل التغيرات الخلوية والهيكلية في اللقيمة الفكية للقوارض.