إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد بروتينات ربط الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية ورسم خريطة لمناطق ربط الحمض النووي الريبي باستخدام الربط المتقاطع للصور بوساطة الأشعة فوق البنفسجية متبوعا بقياس الطيف الكتلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم التخلق ، مثل المنظمين اللاجينية المرتبطين بالحمض النووي الريبي وما هي مناطق البروتين المطلوبة للتفاعلات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تنطوي على تنقية مجمعات الحمض النووي الريبي البروتيني ، وبالتالي تتطلب القليل من المواد وتحدد البروتينات المرتبطة بأي نوع من الحمض النووي الريبي.

كما هو مذكور ، تركز هذه الطريقة على البروتينات النووية لأن هذا هو اهتمامنا العلمي ، ولكن مع تعديلات طفيفة في خطوات التجزئة ، يمكن استخدامها لدراسة الحمض النووي الريبي وبروتينات الربط في مقصورات stu-nu-lar الأخرى. بعد زراعة وتوسيع ESCs للفأر وفقا لبروتوكول النص ، قم بتوسيع الخلايا إلى العدد المطلوب من لوحات 10 سم. قبل أن تصل الصفائح إلى التقاء ، أضف أربعة SU مباشرة في الوسط إلى التركيز النهائي البالغ 500 ميكرو مول.

اترك أطباق التحكم 4sU دون معالجة. رج الألواح برفق لتوزيع 4sU بشكل متجانس في جميع أنحاء الوسط ، ثم أعد الألواح إلى نفس حاضنة زراعة الأنسجة لمدة ساعتين. تختلف كفاءة دمج 4sU باختلاف أنواع الخلايا ، وبالتالي قد يكون من الضروري تحسين تركيزها ووقت الحضانة لضمان الربط المتقاطع الفعال وتقليل السمية.

بعد ذلك ، انقل الأطباق إلى دلو ثلج وتخلص من الوسط. ثم استخدم 5 مل من PBS المثلج لشطف الأطباق برفق. أضف 2 مل من PBS المثلج وضع الألواح بدون أغطية في رابط متقاطع مزود بمصابيح باعثة للأشعة فوق البنفسجية.

قم بإشعاع الصفائح عند إعداد طاقة قدره 1 جول لكل سنتيمتر مربع. يعد الربط المتقاطع الفعال للأشعة فوق البنفسجية أمرا بالغ الأهمية. نوصي باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية B ، ولكن يمكن أيضا استخدام الأشعة فوق البنفسجية.

على أي حال ، يجب تحسين كمية طاقة الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة ويمكن مراقبتها بواسطة PAR-CLIP أو ChIRP. استخدم رافعات الخلايا لجمع الخلايا ونقلها إلى PBS المثلج في أنابيب مخروطية. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 2000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من PBS المثلج مع 2 ملليمولار EDTA و 0.2 مللي مولار PMSF. باستخدام مقياس كثافة الدم ، عد الخلايا. توقع خمسة إلى عشرة ، وعشرة إلى عشرين مليون خلية من ألواح 10 سم و 15 سم ، على التوالي.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 2000 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. لعزل النوى عن الخلايا ، قم بإعداد المخزن المؤقت المثلج البارد A كما هو موضح في بروتوكول النص. قبل الاستخدام ، أضف 0.5 مللي مولار DTT و 0.2 مللي مولار PMSF إلى الكمية المطلوبة من المخزن المؤقت A.أضف 2 مل من المخزن المؤقت البارد إلى الخلايا لغسلها ، ثم قم بتدوير الخلايا عند 2500 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية ، وأضف المخزن المؤقت A المكمل بنسبة 0.2 في المائة من المنظف غير الأيوني وغير المتغيرة ، ثم قم بتدوير العينة عند 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد تدوير الخلايا عند 2500 مرة جم لمدة خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية. تتكون الحبيبات من نوى سليمة خالية من السيتوبلازم.

لتحلل النوى ، أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل إلى الأنبوب. استخدم مسبارا 1/8 بوصة لصوتنة العينة لقص الكروماتين بإعداد سعة 50 بالمائة لمدة خمس إلى عشر ثوان. قم بتدوير العينة عند 12000 مرة جم لمدة خمس دقائق واجمع 175 ميكرولترا فقط من المادة الطافية لتجنب الحبيبات.

بعد ذلك ، قم بقياس تركيز البروتين عن طريق اختبار برادفورد أو تقنية مماثلة. بعد ذلك ، استخدم المخزن المؤقت للتحلل لتخفيف البروتين في العينات المختلفة إلى 1 ملليغرام لكل مليلتر أو أقل تركيز للعينة. أضف محلول DTT 5 مللي مولار إلى المحللة النووية واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

ثم أضف 14 مللي مولار من اليودوأسيتاميد من المرق الطازج واحتضان المحللة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. خفف المحللة بخمسة أضعاف حجم بيكربونات الأمونيوم 50 مللي مولار ، ثم أضف التربسين. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

لتحضير طرف مرحلة واحد حسب الطلب لكل عينة، ضع قرصا من مادة استخراج الطور الصلب C18 في قاع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. أضف 50 ميكرولترا من راتينج Oligo R3 ذو الطور العكسي أعلى القرص C18 ، ثم ضع طرف المرحلة داخل محول الطرد المركزي وضع المحول داخل أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 ملليلتر. أضف 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل بنسبة 100 في المائة إلى الأطراف لغسلها.

ثم الطرد المركزي النصائح عند 1000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة لإزالة المذيب. قم بموازنة الأطراف مع 50 ميكرولتر من 0.1 في المائة من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك أو TFA. ثم قم بتدويرها مرة أخرى.

أضف حمض الفورميك بنسبة 100 في المائة إلى عينة البروتين المهضوم لتقليل الرقم الهيدروجيني إلى 2 إلى 3. بعد ذلك ، قم بتحميل العينة على طرف مرحلة مخصص وقم بالطرد المركزي للعينة عند 1000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة حتى تمر كل العينة عبر الحافة. اغسل الببتيدات الملزمة ب 50 ميكرولتر من 0.1 بالمائة TFA.

بعد ذلك ، بعد تدوير العينة عند 1000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة ، قم بإزالة الببتيدات عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف إلى طرف المرحلة وجهاز الطرد المركزي عند 1000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة لإجبار المخزن المؤقت للشطف على الخروج من الحافة. استخدم جهاز طرد مركزي مفرغ على 150 مرة جم و 1 إلى 3 كيلو باسكال لمدة ساعة واحدة لتجفيف العينة. لإزالة الحمض النووي الريبي المتقاطع من العينة ، أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2x nucleas.

قم بقياس تركيز الببتيد عند 280 نانومتر بافتراض 1 ملليغرام لكل مليلتر من الببتيدات ل و A280 من 1. استخدم 2x المخزن المؤقت للنوكلياز لضبط جميع العينات على ملليغرام واحد لكل مليلتر أو إلى أقل تركيز ، ثم قم بإعداد مزيج رئيسي من 50 ميكرولتر من الماء بالإضافة إلى 1 ميكرولتر من النوكلياز عالي النقاء لكل عينة. امزج 50 ميكرولترا من عينة الببتيد مع 50 ميكرولترا من الماء بالإضافة إلى مزيج النوكلياز الرئيسي.

ثم احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أخيرا ، قم بإجراء كروماتوغرافيا النانو السائلة ، وقياس الطيف الكتلي ، ومعالجة البيانات وفقا لبروتوكول النص. يوضح هذا الشكل مخططا بركانا لنتيجة معرف RBR من ESCs للفأر.

الببتيدات التي تداخلت مع مجال فكرة التعرف على الحمض النووي الريبي باللون الأزرق وتظهر مستويات استنفاد متسقة للغاية. يتم تمييز ببتيد ربط الحمض النووي الريبي من HNRNPC باللون الأحمر. تظهر هنا خريطة حرارية لدرجات معرف RBR التي يتم حسابها كتقدير لاحتمالية ارتباط الحمض النووي الريبي لمنطقة البروتين.

يتم عرض النتيجة على سطح الوحدة الفرعية اللاصقة U1-70k. يشير اللون الأحمر الفاتح بالقرب من ملامسة الحمض النووي الريبي ، كما هو محدد بواسطة التركيب البلوري ، إلى التحديد الصحيح لتفاعل الحمض النووي الريبي للبروتين. في هذا الشكل ، يتم تقديم TET2 على أنه RBP جديد ويتم تعيين نشاط ربط الحمض النووي الريبي إلى منطقة طرفية C عن طريق رسم درجة معرف RBR على طول التسلسل الأساسي للبروتين.

أخيرا ، يمكن التحقق من متطلبات RBR الجديدة هذه عن طريق إجراء PAR-CLIP باستخدام تسلسل النوع البري ومقارنة الإشارة بإشارة متحولة تفتقر إلى RBR المتوقع. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في سبع إلى ثماني ساعات على مدار يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. قبل الربط المتقاطع ، يمكن تحفيز الخلايا بعلاجات مختلفة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيف يبدأ التمايز أو كيف تنظم دورة الخلية تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء إضافات تحتوي على مجمعات الحمض النووي الريبي البروتيني المتشابكة لتحديد مواقع تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتيني مع قياس الطيف الكتلي.