منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو تحديد نهج أساسي في منهجية مفصلة لقياس عدم التجانس الجيني في الموقع المستهدف بطريقة موثوقة وقوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تحرير الجينات مثل كيف يمكن تحليل الطفرات في الموقع وقياسها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها منهجية موحدة للإصلاح الموجه للتماثل أو التصحيح الجيني باستخدام قليل النوكليوتيدات أحادية الشريطة.

لبدء البروتوكول ، قم بزراعة خلايا HTT11619 في 25 مل من الوسط المعد مسبقا لزراعة خلايا HTT116 في قارورة T-175. استنشق الوسط واغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بفوسفات دولبيكو أو PBS ، بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، ثم استنشق PBS. بعد ذلك ، أضف التربسين إلى قارورة T-175 ، باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر.

اسمح للخلايا بالانفصال في حاضنة. اضغط على القارورة لإخراج الخلايا ثم قم بإخماد الخلايا بثمانية ملليلتر من الوسط الكامل على كامل سطح القارورة. ثم قم بعمل ماصة الخليط لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت كتل الخلايا ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

قبل تدوير الخلايا لأسفل ، خذ 10 ميكرولتر من الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر واجمعه مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق لحساب الخلايا ، ثم حبيبات الخلايا. انقل 10 ميكرولترات من الخلايا الممزوجة باللون الأزرق إلى مقياس كثافة الدم واحسب الشبكات الأربع حول الخارج. لكل صفيحة 10 سنتيمترات من الخلايا المراد مزامنتها ، أضف خمسة ملليلتر من الوسط الكامل وستة ميكرومولار من الأفيديكولين.

بعد ذلك ، انقل 100 ميكرولتر من حبيبات الخلية المعاد تعليقها إلى كل لوحة سنتيمتر وقم بتدوير اللوحة برفق للخلط. احتضان اللوحات لمزامنة الخلايا على حدود G1S. قبل أربع ساعات من الاستهداف ، استنشق الوسط ، واغسله باستخدام PBS.

استنشق PBS وأضف خمسة ملليلتر من الوسط الكامل. ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة أربع ساعات. أدخل تسلسل جين EGFP المتحور في مولد Zane Labs عبر الإنترنت واختر تسلسلات دليل CRISPR التي ترتبط على مقربة من الموقع المستهدف.

امزج الحمض النووي الريبي بتركيزات مولية متساوية إلى 45 ميكرومولار. أضف 6.75 ميكرولتر من مخزون 200 ميكرومولار من الحمض النووي الريبي CR و 6.75 ميكرولتر من مخزون 200 ميكرومولار من الحمض النووي الريبي التتبع إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، أضف 16.50 ميكرولتر من المخزن المؤقت IDT لعمل حجم نهائي يبلغ 30 ميكرولترا.

بعد ذلك ، سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، في جهاز PCR. اترك العينات لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. لكل عينة ، قم بتخفيف 2.22 ميكرولتر من CR RNA لمعقد RNA لتتبع مركب RNA و 2.78 ميكرولتر من المخزن المؤقت IDT إلى حجم نهائي يبلغ خمسة ميكرولترات.

خفف 1.67 ميكرولتر من بروتين Cas9 من مخزون 60 ميكرومولار في 3.33 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض ، إلى حجم نهائي يبلغ خمسة ميكرولترات. امزج خمسة ميكرولترات من بروتين Cas9 مع خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المعقد. استنشق الوسط ، واغسله بخمسة ملليلتر من PBS.

استنشق PBS وأضف ملليلترا واحدا من التربسين الدافئ مسبقا إلى كل لوحة 10 سم. ضع الأطباق في الحاضنة. بعد ذلك ، اضغط على اللوحة التي يبلغ طولها 10 سم للتأكد من إزاحة جميع الخلايا ثم قم بإخمادها بأربعة ملليلتر من الوسط الكامل ، عن طريق تشتيتها على كامل سطح اللوحة.

الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفكيك كتل الخلايا ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. ضع جانبا 10 ميكرولتر من الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر وامزجه مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق لحساب الخلايا. قم بتكسير الخلايا عن طريق الدوران لمدة خمس دقائق عند 125 × جم في درجة حرارة الغرفة.

استنشق الوسط واغسله بخمسة ملليلتر من PBS. قذف الخلايا عن طريق تدوير 125 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل كوفيت بفجوة بفارق أربعة ملليمترات كهربائية.

أضف 10 ميكرولترات من مركب RNP إلى 100 ميكرولتر من الخلايا ، بكثافة 5 × 10 إلى كثافة الخلية الخامسة. أضف اثنين من micromolar ODN إلى كل عينة. بعد ذلك ، خذ الرف إلى آلة التثقيب الكهربائي.

بنفض الغبار برفق عن كل عينة وضعها في الغرفة. ضع الرف مرة أخرى في غطاء المحرك وانقل كل عينة إلى بئر يحتوي على ملليلترين من الوسط الكامل في طبق من ستة آبار. احتضان اللوحة قبل التحقق من مستويات التصحيح.

استنشق الوسط واغسل الخلايا بملليلترين من PBS. استبدل PBS ب 500 ميكرولتر من التربسين الدافئ مسبقا لكل بئر من لوحة الآبار الستة. ضع الأطباق في الحاضنة.

بعد ذلك ، اضغط على اللوحة للتأكد من إزاحة جميع الخلايا ثم قم بإخمادها بمليلتر واحد من الوسط الكامل عن طريق تشتيته على كامل سطح البئر. مرر الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مليلتر وحبيبات. بعد تكوير الخلايا, استنشق الوسط, ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.

قم بالكهرباء للخلايا HTT11619 المتزامنة والمطلقة بتركيز 5 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 100 ميكرولتر ، مع مركب RNP عند 100 بيكومول و 100 بيكومول من 72 NTODN عند 2.0 ميكرومولار. انقل الخلايا إلى صفيحة من ستة آبار واتركها تتعافى لمدة 72 ساعة. بعد ذلك ، قم بفرز الخلايا بشكل فردي إلى 96 لوحة بئر ، باستخدام فارز FAC مع ليزر 488 نانومتر ل EGFP زائد ناقص.

من الآبار التي تنمو ، قم بعزل gDNA الخلوي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي المتاحة تجاريا. تضخيم المناطق المحيطة بالقاعدة المستهدفة عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أخيرا ، قم بإجراء تحليل تسلسل الحمض النووي على العينات.

بعد 72 ساعة من تحليل قياس التدفق الخلوي للحضانة ، قم بتأكيد الإصلاح الوظيفي لبروتين الفلورسنت الأخضر. لوحظت استجابة جرعة تدريجية مع زيادة المستويات المنسقة ل RNP و 72NT. قام تفاعل تحرير الجينات في غياب جسيم RNP بتصحيح ما يقرب من 1٪ من الخلايا المستهدفة عند استخدام تركيز أعلى بمقدار 10 أضعاف من قليل النوكليوتيد 72NT في تفاعل تحرير الجينات أحادي العامل.

تم اختيار 16 نسخة من العينات الإيجابية EGFP وتم تحليل السلامة الجينية المحيطة بالموقع المستهدف بواسطة جهاز تسلسل الحمض النووي. احتوت جميع الخلايا الإيجابية ل EGFP البالغ عددها 16 خلية على تبادل النيوكليوتيدات المتوقع في الموقع المستهدف. تم تحليل 15 عزلة نسيلة غير خضراء من أجل عدم التجانس في الموقع المستهدف.

لم يلاحظ أي تبادل لقاعدة الحمض النووي في ما يقرب من نصف العينات. أظهرت ما تبقى من التوسعات النسيلة التي تم فحصها مجموعة غير متجانسة من طفرات الحذف. تراوح حجم الحذف من قاعدة واحدة إلى 19 قاعدة.

يمكن أن تؤدي CRISPR و Cas9 وجزيئات الحمض النووي المانحة لقليل النوكليوتيدات المفردة التي تعمل جنبا إلى جنب إلى الإصلاح الدقيق للطفرة النقطية في جين EGFP كما هو موضح في هذا النموذج الجديد لإصلاح الطفرات النقطية ، وهو مسار جزيئي ، حيث يقوم المتبرع بالوصول إلى قالب النسخ المتماثل للحمض النووي لإصلاح القاعدة الطافرة. عملية أطلقنا عليها اسم ExACT. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تحرير الجينات لاستكشاف درجة عدم التجانس في الموقع المستهدف ، نتيجة لنشاط تحرير الجينات في خطوط الخلايا.