أسلوب لتقييم وظائف المستجيب Fc بوساطة الناجم عن الإنفلونزا هيماغلوتينين أجسام مضادة محددة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقييم قدرة الجسم المضاد أو عينة المصل على تنشيط وظيفة المستجيب بوساطة FC. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم المناعة واللقاحات عن طريق قياس تنشيط المناعة بوساطة FC المعتمدة على الأجسام المضادة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء التجربة في غضون 24 ساعة من إعداد المواد إلى تحليل البيانات.

سيوضح هذا الإجراء مارك بيلي ، طالب الدراسات العليا من مختبر بيتر باليز. للحث على تعبير الهيماجلوتينين بفيروس الأنفلونزا عن طريق التعدي ، تزرع الكلية الجنينية البشرية 293 خلية في مرتين في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل تركيز بئر في صفيحة 96 بئر عالجت مزرعة الأنسجة البيضاء. بعد أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، قم بنقل الخلايا ب 100 نانوجرام من ترميز الحمض النووي للهيماجلوتينين الفيروسي و 0.2 ميكرولتر من كاشف التعداء لكل بئر وحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر من وسط المصل الأمثل 1X.

أضف مجمعات الجسيمات الشحمية للحمض النووي إلى كل بئر لنقلها وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 18 ساعة أخرى. للحث على تعبير الهيماجلوتينين بفيروس الأنفلونزا عن طريق العدوى ، تم معالجة خلايا اللوحة A549 في مرتين 10 إلى الخلايا الرابعة لكل تركيز بئر في مزرعة الأنسجة البيضاء صفيحة 96 بئرا لمدة 18 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. في نهاية الحضانة ، قم بتخفيف فيروس الأنفلونزا إلى عدوى متعددة تبلغ ثلاثة في 100 ميكرولتر من وسط 1X MEM لكل بئر وإصابة خلايا A459 لمدة ساعة واحدة في حاضنة زراعة الخلايا.

في نهاية الحضانة ، استبدل اللقاح ب 100 ميكرولتر من وسط 1X MEM الطازج بدون فيروس وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 18 إلى 24 ساعة أخرى. لتقييم قدرة الأجسام المضادة المحددة ذات الأهمية على استهداف الخلايا التي تعبر عن الهيماجلوتينين ، استبدل المادة الطافية لمزارع الخلايا المصابة بالفيروسات ب 25 ميكرولترا من السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة أو وسيط الفحص ADCC. بعد ذلك ، في لوحة منفصلة مكونة من 96 بئرا ، قم بإجراء أربعة تخفيفات كاملة للأجسام المضادة ذات الأهمية في ثلاث نسخ في وسط ADCC جديد بدءا من 10 ميكروغرام لكل مليلتر وفقا للتخطيطي مع الحرص على تضمين الخلفية وعدم وجود ضوابط للأجسام المضادة.

عندما يتم تخفيف كل الجسم المضاد ، انقل 25 ميكرولترا من الجسم المضاد المخفف إلى الآبار المقابلة المناسبة في لوحة الخلية التجريبية وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلية. بعد 15 دقيقة ، أضف 7.5 في 10 إلى الخلايا المستجيب الرابعة المعدلة Jurkat التي تعبر عن مستقبل Fc المناسب لكل بئر في 25 ميكرولتر من وسط ADCC لحجم نهائي يبلغ 75 ميكرولتر من وسط ADCC لكل بئر. أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ست ساعات لإذابة المخزن المؤقت لركيزة لوسيفيراز في حمام مائي 37 درجة مئوية خلال الساعة الأخيرة من الحضانة.

عندما يكون المخزن المؤقت جاهزا ، أضف 75 ميكرولترا من المخزن المؤقت لركيزة لوسيفيراز إلى جميع الآبار باستثناء بئر التحكم في الخلفية واقرأ اللوحة على مقياس الإلواء. يمكن بعد ذلك حساب تحريض الطية للسمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة في مزارع الخلايا المنقولة أو المصابة. في هذه التجربة ، قام جسم مضاد أحادي النسيلة خاص بالمخزون بتنشيط وتعديل خلايا Jurkat بقوة التي تعبر عن مستقبلات جاما Fc الفئران أربعة بمقدار 14 ضعفا تقريبا مقارنة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالرأس والتحكم في IgG.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تجربة لتقييم قدرة الأجسام المضادة المحددة ذات الأهمية على تنشيط المناعة بوساطة FC.