أسلوب العامة للكشف عن تكوين نيتروساميدي في الأيض في المختبر من نيتروسامينيز من الفسفرة P450s

الهدف العام من هذه المنهجية هو تحديد ما إذا كان السيتوكروم P450s يمكنه أكسدة n نيتروزامين بشكل عملي إلى n nitosamides في المختبر. تفيد هذه الطريقة مجال علم السموم من خلال تقييم ما إذا كان النيتوزامين قد تم استقلاب النيتوزامين مباشرة إلى نيتروساميدات. نظرا لأن النيتروساميد مستقر نسبيا في الحمض النووي للألكلات ، يمكن أن يلعب دورا في التسرطن.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام مطياف كتلة شديد الحساسية يعطي حدود الكشف أقل مما تم تحقيقه سابقا لمقايسات التمثيل الغذائي المماثلة في المختبر. لبدء هذا الإجراء ، ضع قارورة سفلية مستديرة سعة 25 مليلتر ، تحتوي على قضيب تقليب مغناطيسي ، في الفرن. يجف لمدة 16 ساعة عند 140 درجة مئوية.

بعد ذلك ، انقل القارورة إلى غطاء الدخان وقم بتبريدها تحت تيار من غاز النيتروجين. أضف 31.8 ملليغرام من النوركوتينين ، وخمسة ملليلتر من أنهيدريد الخليك ، ومليلتر واحد من حمض الأسيتيك إلى القارورة ، وابدأ في التقليب. انقل القارورة إلى حمام ماء مثلج.

أضف 33.3 ملليغرام من نتريت الصوديوم. استمر في التقليب لمدة 2.5 ساعة ، ثم اسكب التفاعل في 18 مل من الماء المثلج لإخماد التفاعل. انقل المحلول على الفور إلى قمع فاصل يحتوي على 18 مل من DCM ، واستخرج المحلول المائي.

استخرج الطبقة المائية مرتين إضافيتين ، باستخدام 9 مل من DCM في كل مرة. بعد ذلك ، جفف المواد العضوية المجمعة أكثر من 100 ملليغرام من كبريتات المغنيسيوم لمدة دقيقتين. بعد التصفية ، استخدم مبخر دوار لتركيز المحلول عند 30 درجة مئوية لإنتاج زيت أصفر خام.

قم بتنقية المركب الخام باستخدام كروماتوغرافيا العمود كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بإذابة المركب النقي في مليلتر واحد من الكلوروفورم المنزع. باستخدام الرنين المغناطيسي النووي ، قم بتأكيد بنية الحل ومولولاريته كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بتخزين هذا المحلول في الظلام عند درجة حرارة تتراوح بين درجتين وثماني درجات مئوية لحين الحاجة. ثم قم بتأكيد الكتلة الأصلية الدقيقة وتحديد الكتل الأيونية الناتجة لمحلول NNC النقي عن طريق التسريب المباشر على مطياف كتلة عالي الدقة ، كما هو موضح في بروتوكول النص. للبدء ، قم بإزالة الكواشف اللازمة من الفريزر 80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الثلج.

إذابة واحدة ، استخدم عازلة تفاعل بقوة 0.5 لتخفيف الباكولوسومات في نظام تجديد NADPH 1-10 و 1-50 على التوالي ، في أنبوب مليلتر واحد. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولترات من محلول مخزون NADP إلى أنبوب مليلتر واحد يحتوي على 97 ميكرولتر من محلول تفاعل بقوة 0.5. لكل حضانة ، قم بإعداد أنبوب مليلتر واحد عن طريق إضافة 40 ميكرولترا من محلول NNN رباعي ميكرومولار مصنوع من محلول تفاعلي.

أضف 50 ميكرولترا من محلول الإنزيم الذي يحتوي على خمسة بيكومول من P450 2A6 إلى كل أنبوب. احتضان في حمام مائي عند 37 درجة لمدة دقيقتين. ثم أضف 10 ميكرولتر من محلول NADP + المخفف إلى كل أنبوب.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح بين دقيقة و 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف أولا 10 ميكرولتر من 3.0 كبريتات الزنك العادية ، ثم أضف 10 ميكرولتر من 3.0 هيدروكسيد الباريوم العادي لإخماد التفاعل. دوامة الحل لتشكيل راسب أبيض.

بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي عند ثمانية آلاف جي ث لمدة أربع دقائق. اجمع المادة الطافية على الفور ، وحلل ميكرولترين بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة التأين النانوي الإيجابي الرش الكهربائي عالي الدقة قياس الطيف الكتلي الترادفي. في هذه الدراسة ، يتم نتروجين النوركوتينين إلى NNC بشكل نظيف وبإنتاجية عالية ، مما ينتج عنه معيار للاستخدام في تجربة المختبر.

يتم التحقق من نجاح التفاعل من خلال التحليل الطيفي ، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي الترادفي عالي الدقة ، والذي أكد أن كتلة الوالد تقع في حدود خمسة أجزاء في المليون من القيمة النظرية. ثم يتم استخدام تجزئة قياس الطيف الكتلي الترادفي ل NNC لتحديد الكتل الأيونية الأكثر وفرة للناتج. كما يتضح ، فإن أيونات المنتج الأكثر وفرة هما 134 و 162 ، مع اكتشاف دقيق للكتلة إلى خمسة منازل عشرية.

ثم يتم استخدام NNC المركب كمعيار لمقايسة التمثيل الغذائي P450 في المختبر. في ظل الظروف المستخدمة ، يمحو NNC الاصطناعي في حوالي 17.5 دقيقة ، مع قمم محلولة جيدا في كل من قنوات أيون الأصل وقنوات أيون المنتج. وفقا للتحكم الإيجابي ، يظهر تكوين NNC في حضانات مدتها دقيقة واحدة وخمس دقائق و 10 دقائق.

إذا تم إجراؤه بشكل صحيح ، يمكن إجراء التحليل التماشي لتخليق النيتروساميد في غضون ست ساعات تقريبا. وبالمثل ، يجب ألا يستغرق الاختبار في المختبر مع حضانات متعددة أكثر من ثماني ساعات. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تقييم مخاطر السرطانات المرتبطة بالتبغ ، لأن قياس المؤشرات الحيوية ذات الصلة بالنيتروساميد يمكن أن يكون مفيدا حول تنشيط النيتروزامين الفردي.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر معالجة حضانات الإنزيم بسرعة. تحلل النيتروساميد في ظل هذه الظروف ويجب ألا يجلس لفترة طويلة قبل تحليل المواصفات الشاملة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير معايير النيتروساميد ، وتقييم ما إذا كانت قد تشكلت في المختبر بواسطة نظام السيتوكروم النيتروزامين P450 المناسب.

لا تنس أن العمل مع NNN أو NNC أو المواد المسرطنة ذات الصلة يمكن أن يكون خطيرا. يجب دائما التعامل مع هذه المركبات في غطاء الدخان أثناء ارتداء معطف المختبر ونظارات السلامة والقفازات. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تخزين جميع النفايات المسببة للسرطان ووضع العلامات عليها بشكل صحيح.