كامل الخلية التيارات الناجمة عن تطبيق نفخة GABA في الدماغ شرائح

الهدف العام من تقنية النفخة هذه هو إجراء الإدارة الدوائية في تسجيل مشبك التصحيح للخلية بأكملها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الفيزيولوجيا الكهربية ، مثل الإدارة الدوائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تركيز الدواء حول موقع التسجيل يزداد بسرعة ، وبالتالي يمنع مستقبلات الغشاء من إزالة التحسس.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تحضير شريحة قشرة الفص الجبهي الحادة وموضع الماصة الدقيقة النفخة أمر صعب نسبيا. لبدء هذا الإجراء ، سحق محلول القطع المجمد للحصول على الطين. احتفظ بالمحلول السلاش على الثلج ، وقم بفقاعاته بنسبة 95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك ، ضع الرأس المقطوع في دورق مملوء بمحلول التقطيع المثلج ، ثم أخرجه بعد بضع ثوان. اقطع الجمجمة على طول خط الوسط في اتجاه الذيلية المنقارية بمقص ناعم ، وقم بإزالة أجزاء الجمجمة الجانبية. ثم قم بإزالة الدماغ بملعقة دقيقة ، وقم بإسقاطه في محلول القطع المثلج.

بعد ذلك ، ضع الدماغ على غطاء طبق بتري طوله تسعة سم مليء بالثلج. شطف الدماغ بمحلول القطع المثلج. ثم اقطع المخيخ والبصلة الشمية بشفرة حلاقة.

بعد ذلك ، ضع غراء cyanoacrylate على حامل عينة Vibratome. ضع كتلة الدماغ بحذر على قطرة الغراء ، الجانب المنقاري لأعلى ، واغمرها على الفور في محلول القطع المثلج. اضبط حامل الشفرة بزاوية 15 درجة مع الإشارة إلى المستوى الأفقي.

قسم أنسجة المخ إلى شرائح إكليلية 350 ميكرون. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى غرفة الاسترداد المملوءة ب ACSF ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة مع فقاعات مستمرة بنسبة 95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في تجربتنا ، يعد تحضير شريحة قشرة الفص الجبهي الحادة أمرا بالغ الأهمية أيضا في الإجراء.

شريحة الدماغ السليمة تعني الخلايا العصبية النشطة التي يمكن ترقيعها بإحكام. في هذا الإجراء، اصنع ماصات دقيقة من البورسليكات الزجاجية لاستخدامها كأقطاب تسجيل أو ماصات دقيقة نفخة. بالنسبة لتسجيل الأقطاب الكهربائية ، تتراوح مقاومة الأطراف من أربعة إلى ستة ميغا أوم ، بينما تكون الماصات الدقيقة المنتفخة لها أقطار طرف في حدود اثنين إلى خمسة ميكرومتر.

أضف مانع قناة sodion إلى ACSF لمنع قناة sodion السريعة وبالتالي إمكانات العمل ، والحفاظ على معدل تدفق ثابت لهذا المحلول من اثنين إلى ثلاثة ملليلتر في الدقيقة في غرفة التسجيل. قم بتعبئة ACSF بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون باستمرار لضمان صلاحية الشرائح. انقل شريحة من الدماغ إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة باستور مع قطع طرفها الناعم لتناسب حجم الشريحة.

بعد ذلك ، ضع مرساة شريحة بلاتينية فوق الشريحة لتثبيتها على المنصة. بعد ذلك، املأ الماصات الدقيقة المسجلة بمحلول داخلي، واملأ الماصات الدقيقة النفخة ب GABA عند 10 ميكرومولار و50 ميكرومولار و100 ميكرومولار أو ACSF كوحدة تحكم في السيارة. لمنع الانسداد بالحطام ، قم بالضغط الإيجابي الطفيف باستخدام حقنة سعة ملليلتر واحد قبل غمر قطب التسجيل في ACSF.

تحت المجهر، ضع قطب التسجيل والماصة الدقيقة النفخة بحيث تظهر الأطراف في وسط الشاشة. ثم حدد الخلية العصبية المستهدفة. اضبط تركيز المجهر مع خفض الماصة الدقيقة النفخة تدريجيا، وضعها فوق الخلايا العصبية المسجلة بزاوية 45 درجة.

حافظ على المسافة بين طرف الماصة الدقيقة النفخة والخلايا العصبية المستهدفة في حدود 20 إلى 40 ميكرومتر. اقترب ببطء وحذر من الخلايا العصبية باستخدام قطب التسجيل ، ثم حرر الضغط الإيجابي. ضع شفطا ضعيفا وقصيرا من خلال الأنبوب المتصل بحامل القطب الكهربائي لإنشاء ختم جيجا أوم.

حافظ على الجهد عند صفر مللي فولت. بعد تشكيل ختم الجيجاأوم ، قم بتعويض السعة السريعة والبطيئة يدويا أو تلقائيا. بعد ذلك ، قم بتطبيق شفط قصير وقوي من خلال الأنبوب لاقتحام وضع الخلية بأكملها.

بعد ذلك ، سجل تيارات IPSC التي أثارت في وضع مشبك الجهد. قم بتوصيل نفخات GABA مفردة أو مقترنة من خلال الماصة الدقيقة النفخة التي يتم التحكم فيها بواسطة مولد خطوة الجهد Master-8. قم بتغيير مدة النفخة للحصول على أفضل نتائج تيارات IPSC المستحثة ، وقياس تيارات IPSC المستحثة في نموذج الاكتئاب الناجم عن LPS.

كما هو موضح هنا ، هي عينة IPSCs المستحثة بواسطة 10 و 50 و 100 ميكرومولار GABA. وإليك منحنيات استجابة مدة النفخة. تظهر هنا التيارات المتكررة التي تثيرها GABA عند 50 نفثا ميكرومولار على فترات فاصلة مدتها ثانية واحدة أو ثانيتين أو ثلاث ثوان.

يمكن إتقان هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحصول على شرائح دماغ صحية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الإدارة الدوائية لاستكشاف تأثير الدواء في الفيزيولوجيا الكهربية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الإدارة الدوائية في تسجيل مشبك التصحيح للخلية بأكملها. لا تنس أن العمل مع TTX يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.