متعدد الفلورة التحليل والقياس الكمي ل Intratumoral PD-1⁺ CD8 تيم-3^{+ +} تي الخلايا

الهدف العام من هذا التحليل المناعي متعدد الإرسال هو حساب الخلايا تلقائيا بناء على نمطها الظاهري. تسمح هذه الطريقة بالعد المتعدد الفلوري والتلقائية للخلايا لتحليل النمط الظاهري ووظيفة الخلايا المناعية للورم داخل بيئة مكروية للورم. سهلت هذه التقنية توليد نوعين من التشخيص المركب للتنبؤ به بواسطة العلامات المشتقة مباشرة من البيئة المكروية للورم.

بشكل عام ، قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن إجراء الكتابة الظاهرية طويل جدا وتتطلب البيانات الأولية الناتجة مزيدا من المعالجة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما حاولنا توصيف النمط الظاهري والتفاعلات المناعية لخلايا annhodge miranty. بعد الذوبان ، استخدم منشفة ورقية لتجفيف الشرائح بعناية حول أقسام المناديل ثم ضع دائرة حول الأنسجة بقلم حاجز كاره للماء.

عندما يجف الحاجز ، قم بإصلاح العينات في 100٪ من الأسيتون لمدة خمس دقائق ، متبوعة بدقيقتين من التجفيف بالهواء ، ثم اغسل الشرائح في TBS لمدة 10 دقائق. عالج الشرائح مسبقا ب 3 قطرات من 0.1٪ Avidin لمدة 10 دقائق في الظلام ، ثم اضغط أو قم بالنقر فوق الشرائح لتغطية المنديل بمحلول Avidin. أضف 3 قطرات من 01٪ بيوتين إلى كل عينة ، ثم اضغط أو انقر فوق البيوتين عبر العينات متبوعا بغسل TBS كما هو موضح للتو.

ثم قم بمنع أي ارتباط غير محدد ب 100 ميكرولتر من مصل طبيعي بنسبة 5٪ في TBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اضغط على الشرائح لإزالة المصل الزائد واحتضان الشرائح في 100 ميكرولتر من كوكتيل الجسم المضاد الأساسي محل الاهتمام لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة. اغسل الأجسام المضادة المسمى الشرائح في TBST لمدة خمس دقائق.

بعد التجفيف ، قم بتسمية الخلايا ب 100 ميكرولتر من كوكتيل الجسم المضاد الثانوي المعني لمدة 30 دقيقة في الغرفة المرطبة ، متبوعا بغسل لمدة 10 دقائق في TBS. احتضان الشرائح المسماة بالأجسام المضادة الثانوية المجففة ب 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الثلاثية محل الاهتمام لمدة 30 دقيقة متبوعا ب 10 دقائق من غسل TBS. في نهاية الغسيل ، جفف الشرائح وقم بتركيب المناديل بوسط تركيب مكمل دابي.

ثم برسيم كل شريحة مع غطاء زلة واترك وسط التثبيت لمدة ساعتين على الأقل. لمسح الشرائح ضوئيا ، افتح برنامج المجهر وقم بتحميل بروتوكول مسح الصورة. قم بتحميل الشريحة الأولى على مرحلة المجهر.

ثم في شريط التحكم ، انقر فوق تعيين التعريض الضوئي واضبط وقت التعرض لكل مرشح حتى يتم الحصول على إشارة كافية ولكن غير مشبعة. انقر فوق ابدأ في اللوحة العلوية وافتح مجلد LabID. أدخل معرف الشريحة الأولى وانقر فوق التالي.

للحصول على نظرة عامة على الشريحة تحت ضوء المجال الساطع بتكبير 4 أضعاف، انقر فوق التصوير أحادي اللون وابحث عن العينة. لتحديد الأنسجة المراد مسحها ضوئيا، اضغط على مفتاح التحكم واستخدم المؤشر لتحديد أو إلغاء تحديد المناطق ذات الاهتمام المراد مسحها ضوئيا عند التكبير 4x. للحصول على صورة فلورسنت باللون الأحمر / الأزرق / الأخضر لكل منطقة ، انقر فوق تخيل الطاقة المنخفضة.

لتحديد مجال الطاقة العالية ، اضغط على مفتاح التحكم وحدد خمس مناطق اهتمام على الأقل تتوافق مع مناطق الأنسجة التي سيتم مسحها ضوئيا عند التكبير 20x. بعد ذلك ، للحصول على الحصول على صورة متعددة الأطياف لكل حقل ، انقر فوق تخيل عالي الطاقة ، وانقر فوق تخزين البيانات لتخزين الصور في مجلد معرف المختبر المناسب. لإنشاء مشروع جديد ضمن قائمة الملف، حدد مشروعا جديدا، ضمن قائمة البحث عن الميزة، حدد تجزئة الخلية، وضمن قائمة الكتابة الفينوية، حدد كتابة فينو، ثم انقر فوق تكوين.

في تنسيق الصورة، حدد متعدد الطيف. في شكل عينة ، اختر التألق. لدمج الصور التمثيلية في المشروع ، ضمن قائمة الملف ، انقر فوق فتح الصورة وحدد 10-30 صورة تمثيلية للسلسلة بأكملها.

لإزالة الإزهار التلقائي ، افتح الشريحة غير الملوثة ، وحدد مصدر المكتبة والفلوروفورات المناسبة. انقر فوق الإزهار التلقائي وحدد منطقة الإزهار التلقائي على الشريحة الفارغة. لإنشاء صورة مركبة، حدد إعداد الكل لدمج مكتبة التألق وأطياف الفلورسنت التلقائية.

انقر فوق أيقونة العين لفتح لوحة محرر العرض وقم بإلغاء تحديد autoflourescence لقص إشارة autofatescence. حدد لونا مناسبا لكل علامة. لتقسيم الخلايا، في قائمة الحجرة، حدد النوى والغشاء.

ضمن قائمة النوى ، قم بتعيين DAPI كبقعة مضادة للنواة. انقر فوق الخلايا المقطعة وتحقق من تجزئة النوى في أغشية الخلايا. للكتابة الظاهرية للخلايا، ضمن قائمة النمط الظاهري، انقر فوق إضافة.

لإنشاء فئات النمط الظاهري للخلية، حدد أكثر من خمسة ممثلين لمجموعة Fluorophor وFluorophor، وانقر فوق مصنف القطار. يقوم المصنف بإنشاء خوارزمية تنسب نمطا ظاهريا لكل خلية بفاصل زمني للثقة. تكبير والتحقق من الأنماط الظاهرية للخلايا.

ثم انقر فوق النمط الظاهري الكل لحفظ خوارزمية النمط الظاهري ومشروع الصورة ، ضمن قائمة الملف ، حدد حفظ المشروع. ثم قم بتسمية المشروع واحفظه. لإجراء تحليل دفعي للسلسلة ، حدد تحليل الحمام وحدد المشروع المحفوظ.

حدد مجلدا لتخزين البيانات المجمعة. أضف الصور المراد تحليلها ثم انقر فوق تشغيل. في نهاية التحليل ، تحقق من جودة الصورة المركبة وتحقق من الكتابة الفينوية لجميع الصور داخل السلسلة.

يكشف تحليل الورم المتسلل للخلايا التائية الإيجابية CD8 ، على عينة من سرطان الخلايا الكلوية الشفافة عن طريق التصوير الفلوري متعدد الأطياف أن ما يقرب من نصف الخلايا التائية الإيجابية CD8 تكون موجبة واحدة ل PD-1 وحوالي 1/3 لتكون إيجابية مزدوجة ل PD-1 و Tim-3. بعد دمج هذه الإشارات الخلوية المختلفة في قسم الأنسجة ، يكشف قياس شدة الإزهار PD-1 على PD-1 إيجابي Tim-3 مقابل PD-1 الإيجابي ، Tim-3 سلبي CD8 ، يكشف أن PD-1 MFI يكون أعلى عندما يتم التعبير عن Tim-3 بشكل مشترك مما يعزز الأهمية الوظيفية لتعبير Tim-3. في هذه التجربة التمثيلية ، كان 66٪ من مرضى الأورام الكلوية إيجابيين أيضا لتعبير PD-1 Ligand و 100٪ كانوا إيجابيين ل Tim-3 ligand Galactin-9.

أظهر التسجيل السريري لأنسجة الورم من مرضى سرطان الخلايا الكلوية العلاقة الإيجابية بين عدد ونسبة الورم الذي يتسلل إلى الخلايا التائية الإيجابية CD-8 التي تعبر عن PD-1 و Tim-3 ومعلمات التسجيل التنبؤية ولكن ليس PD-1 CD-8 الإيجابي الذي لا يعبر عن Tim-3. ومن المثير للاهتمام ، أن مرضى سرطان الخلايا الكلوية الذين يعانون من خلايا تائية إيجابية CD-8 تعبر عن PD1 مع Tim 3 فوق النسبة المئوية المتوسطة كانوا أكثر عرضة للانتكاس بينما تم العثور على التعبير عن PD-1 بدون تعبير Tim-3 المشترك لا يرتبط بانتكاس المريض. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراجعة النمط الظاهري للخلايا مع اثنين من المحققين المنفصلين بما في ذلك أخصائي علم الأمراض إن أمكن.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء أمور أخرى مثل القياس الخلوي للإجابة على أسئلة إضافية حول التأثير الوظيفي للنمط الظاهري الذاتي بعد تحفيز x-vivo. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السرطان لاستكشاف الاستجابات المناعية في الأعضاء المتأثرة.