إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب

التصوير نسيج الشبكية يمكن أن توفر معلومات الخلايا المفردة التي لا يمكن جمعها من الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. ويصف هذا البروتوكول إعداد الشرائح الشبكية من الزرد لتصوير [كنفوكل]. فلوري وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار أو الأصباغ مؤشر يسمح التصور للعديد من العمليات البيولوجية في أنواع مختلفة من الخلايا الشبكية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير شرائح جديدة من شبكية الزرد للتجارب التي تتطلب تصويرا حيا لبروتينات الفلورسنت أو أجهزة الاستشعار الحيوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الرؤية ، مثل الأدوار الفسيولوجية والتمثيل الغذائي لأيونات الكالسيوم في أنواع معينة من الخلايا والأجزاء الخلوية داخل شبكية العين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر معلومات مكانية وزمانية حول المستقلبات الرئيسية وجزيئات الإشارات في الأنسجة الحية.

لتمكين إزالة ظهارة صبغة الشبكية ، أو RPE ، من أسماك الزرد ، قم بتكييف الأسماك لمدة ساعة واحدة قبل صنع شرائح الأنسجة. بالنسبة لغرفة التقطيع ، قم بطلاء خطوط طلاء الأظافر على شريحة. باستخدام طلاء أظافر شفاف ، قم بطلاء خطوط ضيقة لإنشاء مستطيل.

أعد طلاء الملمع مرة واحدة عندما يجف. إذا تم استخدام الغرفة للتصوير الثابت ، أو تجارب الحقن بأقل تدفق للمحلول ، فاستخدم حقنة لتطبيق شريطين متوازيين من الفازلين على غطاء ، بطول سنتيمتر واحد ومسافة 0.5 سم. الآن تحضير الشفرات.

أولا ، نظف ماكينة حلاقة ذات حدين بالإيثانول واتركها تجف في الهواء. ثم استخدم المقص لتقطيعه إلى قطع بحجم سنتيمتر واحد تقريبا. بعد ذلك ، ضع غرفة التقطيع على مسرح قطاعة الأنسجة ، وقم بتوسيطها أفقيا على المسرح ، وقم بتمييز الحافة الطويلة بعلامة دائمة للمحاذاة.

ثم قم بتحميل قطعة من الشفرة على ذراع التقطيع. قم بتأمين الشفرة ، بحيث تكون الحافة فوق منتصف الشريحة وتعمل بالتوازي مع سطح الشريحة ، لكنها لا تلمس طلاء الأظافر. ثم اخفض ذراع الشفرة باستخدام ربع دورة.

الآن ، حاول تقطيع ورق الترشيح. أعد تركيب الشفرة إذا لزم الأمر. للمضي قدما ، باستخدام المحقنة ، قم بإيداع نقطة صغيرة واحدة من الهلام في طبق 10 سم ، على بعد حوالي 1.5 سم من نقطة المنتصف.

ثم اضغط على الجانب الجاف من الغطاء في الهلام باستخدام الملقط. بعد ذلك ، ضع نقطة صغيرة أخرى من الهلام على بعد حوالي سنتيمتر واحد من حافة مدخل غرفة التصوير. الآن ، استخدم إبرة قياس 20 لعمل شريطين متوازيين رفيعين بطول سنتيمتر واحد من الفازلين بالطول على طول مركز غرفة التقطيع على بعد حوالي سنتيمتر واحد.

ثم انقل سمك الزرد إلى طبق وقم بخلع السمكة في عنق الرحم دون قطع الرأس. الآن ، استخدم حلقة سلكية لفك النسيج الضام حول عين واحدة ثم اسحب العين للأمام برفق. بعد ذلك ، قم بقص العصب البصري الأبيض تحت العين بعناية باستخدام مقص دقيق ، لكن لا تقطع الجزء الخلفي من العين.

للمتابعة ، انقل العين إلى طبق من محلول Ringer البارد على الثلج. ثم حصاد العين الأخرى. استمر في العمل تحت الضوء الأحمر حتى تتم إزالة كل RPE.

بعد ذلك ، انقل عين واحدة إلى قطرة من محلول Ringer البارد على شريحة زجاجية على طبق بتري. ثم ضع الطبق تحت مجهر تشريح منخفض الطاقة لتشريح كوب العين تحت الضوء الأحمر. أولا ، اخترق القرنية بالملقط الناعم.

بعد ذلك ، استخدم الملقط والمقص لإزالة قطع القرنية الهشة الشفافة والصلبة الفضية برفق. ثم قم بإزالة العدسة والتخلص منها ، ومعظم الصلبة لعزل كوب العين. مع الحد الأدنى من المناولة ، قم بإزالة أي قطع من الدهون والصلبة التي تظل ملتصقة بكوب العين دون إزالة شبكية العين.

إذا انفصلت شبكية العين عن RPE ، فتابع بحذر شديد لتجنب إتلاف شبكية العين الحساسة. الآن ، أعد وضع كوب العين مع الجانب المفتوح لأسفل وقم بتقطيعه إلى أثلاث أو أرباع بشفرة جديدة. تخلصي من قطع كوب العين المنحنية جدا بحيث لا يمكن تسطيحها.

غالبا ما تكون هذه القطع صغيرة جدا بحيث لا تكون مفيدة على أي حال. لتركيب أقسام الشبكية ، بلل قطعة من ورق الترشيح بمحلول Ringer واستخدم ملقطا مسطحا لوضعها بجوار قطع كوب العين. ثم اغمر ورق الترشيح والمناديل في محلول Ringer البارد.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لوضع قطع شبكية العين فوق ورق الترشيح مع RPE والمستقبلات الضوئية لأعلى. تعامل برفق مع حواف قطع كوب العين باستخدام ملقط دقيق لتوجيهها إلى خط واحد في منتصف ورق الترشيح. الآن قم بتسطيح شبكية العين باستخدام ملقط لرفع ورق الترشيح مع شبكية العين المرفقة ووضعها على منشفة ورقية جافة.

لمدة ثلاث ثوان تقريبا ، دع قوة فتل السائل في المنشفة الورقية تسطيح شبكية العين. قم بمعالجة جميع قطع شبكية العين بهذه الطريقة ، فقط لا تدعها تجف. الآن ، ضع قطرة من محلول Ringer واستخدم ملقطا دقيقا لتقشير أي صفائح سوداء متبقية من RPE من الأنسجة.

قشرها برفق ، وإذا رفعت شبكية العين عن الورق ، فتخلص من المزيد من المحلول كما كان من قبل ويجب أن تتسطح مرة أخرى. الآن انقل الورقة بقطع شبكية العين إلى شريحة وقم بقص الورق إلى مستطيل مع ترك حوالي 0.5 سم على جانبي صف الأنسجة. ثم انقل ورق الترشيح إلى غرفة التقطيع المعدة.

ادفع حواف ورق الترشيح الطويلة في خطوط الفازلين الرقيقة باستخدام الملقط ، ثم اغمر شبكية العين في ثلاث إلى أربع قطرات من محلول Ringer البارد. أولا ، انقل المستحضر إلى مرحلة تقطيع الأنسجة. ضع الحافة الطويلة على طول الخط المحدد وقم بتأمين نهايات الغرفة على المسرح بشريط مختبر.

ثم ، بدءا من أحد طرفيه ، قم بقص شبكية العين وورق الترشيح باستخدام ضغط قوي ولطيف على ذراع التقطيع. تأكد من قطع الشريحة الأولى بالكامل ، ثم تابع استخدام الميكرومتر لتقطيع الشرائح التي يبلغ سمكها حوالي 400 ميكرون. بعد ذلك ، انقل الغرفة ذات الأقسام المقطعة إلى طبق بتري الذي يحتوي على الغطاء المحضر ، والذي سيكون بمثابة سلم تصوير.

اغمر الطبق بمحلول Ringer البارد وضعه على مسرح مجهر التشريح. الآن ، تحت التكبير المنخفض ، استخدم الملقط لتأمين شريط ونقله إلى سلم التصوير عن طريق تحريك طبق بتري الأساسي. قم بتدوير الشرائح 90 درجة ودفن حواف ورق الترشيح في الهلام.

من المهم إبقاء شبكية العين مغمورة وتجنب أي اتصال مباشر بالشبكية. بعد ذلك ، أعد وضع الشرائح في السلالم بحيث تكون طبقات شبكية العين مرئية بوضوح. بالنسبة للشرائح الموجودة في كل طرف من طرفي السلم ، اجعل شبكية العين متجهة للداخل باتجاه الشرائح الأخرى لتقليل الحركة أثناء الحقن أو التدفق.

تخلص من أي شرائح لا تلتصق جيدا بالورق. الآن ، وصمة عار الأنسجة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد غرفة التصوير وجهاز الحقن.

أولا ، اغسل الأنبوب بمحلول Ringer ، حتى تختفي فقاعات الهواء. ثم قم بتوصيل الأنبوب بمدخل غرفة التصوير وأغلق قضيب التوقف. ثم أعد ملء المحقنة بمحلول الحقن وأعد توصيلها بالأنبوب.

الآن ، استخدم الملقط لنقل سلم التصوير المعد إلى غرفة التصوير. اضغط عليه في نقطة الهلام بالقرب من حافة المدخل واملأ الغرفة بمحلول Ringer لتغطية الشرائح. ثم تابع التصوير.

باستخدام التقنيات الموصوفة ، يمكن تصوير الشرائح المستعرضة تماما من خلال جميع طبقات الشبكية. عند تدويرها قليلا ، ستكون حزم الأجزاء الخارجية مرئية. باستخدام تلطيخ PI ، يمكن التخلص من الخلايا الميتة من التحليل.

المستقبلات الضوئية السلبية PI الصحية لها مورفولوجيا ممدودة مستقطبة نمطية. عندما تكون في Ringer المؤكسج ، يمكن تصويرها لمدة تصل إلى أربع ساعات. تتمثل إحدى استراتيجيات التصوير في تصور ديناميكيات الشبكة الإندوبلازمية المخروطية المستقبلة للضوء بالنسبة للنواة.

استخدام الأنسجة التي تعبر عن GFP ، و ER المخروطي ، مع مكافحة البقع بصبغة نووية. يمكن استخدام استراتيجية مماثلة لعرض الهيكل الخلوي للأكتين مع الأنسجة التي تعبر عن الأكتين المنصهر ب GFP. باستخدام التصوير المنقضي زمنيا ، يمكن ملاحظة الديناميكيات الخلوية مثل تقلبات الكالسيوم العصارية الخلوية في المستقبلات الضوئية المخروطية.

على سبيل المثال ، أثناء استنفاد الصوديوم متساوي التوتر في غرفة التصوير ، يمكن استخدام GCaMP لتصور ارتفاع تركيزات الكالسيوم العصارية الخلوية. من خلال تحديد استجابات التألق من الأجزاء الخارجية المخروطية المفردة وأجسام الخلايا والمشابك العصبي ، يمكن تحديد ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا أثناء التلاعب الدوائي وما إلى ذلك. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الضوء الأحمر قبل إزالة RPE.

افرد أكواب العين بعناية قبل التقطيع ، واحتفظ بالشرائح مغمورة في جميع الأوقات. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تشريح الأنسجة والتقطيع والتحضير للتصوير في أقل من 30 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح الشبكية من أسماك الزرد لدراسة التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء في أنواع معينة من الخلايا في المقصورات الخلوية.