إنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج الجيني

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إنتاج الفيروس العصبي في زراعة خلايا الحشرات ، والتنقية باستخدام كروماتوغرافيا تقارب الهيبارين والتركيز باستخدام الطرد المركزي الفائق. يمكن استخدام المنتج النهائي لنقل الجينات في الجسم الحي أو كلقاح. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين الذين يرغبون في استخدام الفيروس الباكولوفيري المنقى والمركز لتطبيق العلاج الجيني.

قد تحتوي جزيئات الفيروس العصبي على بقايا خلوية وبروتينات من مزرعة Sf9 والتي قد تسبب الالتهاب أو الاستجابة المناعية عند استخدامها في البشر. لتجنب السمية ، يتم تنقية الفيروس العصبي وفصله عن الجسيمات الملوثة. سيتم عرض بعض أجزاء الإجراء من قبل ماريلو نارسيسو ، مساعدة باحثة من مختبري.

لإعداد ثقافة التعليق ، قم بزرع 50 مل من خلايا Sf9 في وسط زراعة الحشرات في قارورة 250 مل من البولي كربونات Erlenmeyer. وضع القارورة في حاضنة شاكر مدارية. أضف ملليلترين من مخزون الفيروس العصبي P2 إلى الخلايا ، ورجه عند 135 دورة في الدقيقة مع الحفاظ على درجة حرارة ثابتة تبلغ 28 درجة مئوية.

بعد أربعة أيام من الإصابة ، ستظهر مجموعة خلايا Sf9 بأكملها تأثير الاعتلال الخلوي ، وهو مؤشر على إنتاج فيروس باكوجو عالي العيار. قم بتضخيم الفيروس العصبي بالتتابع حتى يتم الحصول على الحجم المطلوب ، عن طريق زيادة حجم زراعة الخلايا في كل عدوى لاحقة من 10 إلى 50 ضعفا. بعد الطرد المركزي الطافي النهائي للفيروس الباكولوجيني لمدة 30 دقيقة عند 1000 جرام وأربع درجات مئوية لفصل الحطام الخلوي ، انقل المادة الطافية إلى وعاء نظيف ومعالجتها بالنوكلياز بمعدل 50 وحدة لكل مليلتر لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية لهضم الحمض النووي الجيني والحمض النووي الريبي.

أخيرا ، قم بتصفية المادة الطافية الفيروسية من خلال وحدة ترشيح 0.45 ميكرون. قم بإعداد نظام الكروماتوغرافيا عن طريق وضع خط الغسيل العازل من منفذ المدخل A1 في زجاجة تحتوي على 500 مل على الأقل من مخزن الغسيل المؤقت. استخدم منفذ مدخل المخزن المؤقت A2 لتحميل المخزن المؤقت للشطف.

أدخل عدة أنابيب مخروطية سعة 50 مل في مجمع الكسر لجمع العمود الطافي الذي يمر عبر الفيروس العصبي ، والمخزن المؤقت للغسيل ، والفيروس الباكيو. قم بموازنة عمود الهيبارين بخمسة أحجام أعمدة سعة 7.9 مل من عازلة الغسيل بمعدل تدفق خطي يبلغ سبعة ملليلتر في الدقيقة. قم بتحميل 250 مل من المادة الطافية لفيروس الباكولو ، على عمود الهيبارين باستخدام مضخة العينة لمنفذ عينة المدخل بمعدل تدفق خطي يبلغ ملليلترين في الدقيقة.

ثم قم بتشغيل 10 أحجام أعمدة من مخزن الغسيل عبر عمود الهيبارين بمعدل تدفق خطي يبلغ ملليلترين في الدقيقة حتى يعود منحنى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية إلى خط الأساس ويصبح مستقرا. مراوغة جزيئات الفيروس العصبي من عمود الهيبارين بخمسة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للشطف بمعدل تدفق خطي يبلغ أربعة ملليلتر في الدقيقة. راقب ذروة شطف حادة للبروتين على الكروماتوجرام عندما تنفصل جزيئات الفيروس العصبي عن عمود الهيبارين.

بعد الشطف ، قم على الفور بتخفيف المادة الطافية للفيروس الباكولو المراوغة 10 أضعاف باستخدام محلول فوسفات الصوديوم 20 ملم لمنع تنشيط جزيئات الفيروس العصبي من الصدمة التناضحية أثناء الطرد المركزي اللاحق. ابدأ إجراء التركيز بإضافة حجم متساو من المادة الطافية لفيروس باكولور إلى الأوتوكلاف إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق. قم بقياس وزن الأنبوب عن طريق الميزان واضبط وزن محتويات أنابيب الطرد المركزي الفائق باستخدام PBS المعقم.

ضع كل أنبوب من أنابيب الطرد المركزي الفائق في دلو معاكس من دوار SW 32 Ti وقم بتشغيل جهاز الطرد المركزي الفائق عند 80،000 جم لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، افتح أنابيب الطرد المركزي الفائق في غطاء زراعة الأنسجة وشفط السائل بشكل معقم دون إزالة حبيبات الفيروس العصبي. أضف 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.5٪ BSA وأعد تعليق كل حبيبات عن طريق سحب العينة بقوة لأعلى ولأسفل.

أخيرا ، انقل 50 إلى 100 ميكرولتر من الفيروس الباكلي المركز إلى cryovials وتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية. تم تقدير عيار الفيروس العصبي عن طريق إصابة خلايا HT1080. يظهر الخط المتصل بالماس إجمالي الوحدات المعدية للفيروس العصبي في كل جزء.

ترتبط جزيئات الفيروس العصبي بقوة بعمود الهيبارين ، وبالتالي لا يتم اكتشاف كمية كبيرة من الفيروس في المخزن المؤقت لغسيل العمود. لوحظت ذروة حادة من البروتين أثناء الشطف ، والتي تتوافق مع جزء الفيروس العصفي. تعمل المعلمات المستخدمة في هذا البروتوكول على زيادة العائد وتقليل تعطيل جزيئات فيروس الباقولو المعدية.

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتنقية الفيروسات والبروتينات الأخرى التي لها صلة بمادة الهيبارين.