تحليل الحركية فاسكولوجينيسيس يقد ديناميات فاسكولوجينيسيس والأوعية في المختبر

الهدف العام لهذه الطريقة التجريبية هو تصور وتحديد العملية الديناميكية لتكوين الأوعية الدموية بمرور الوقت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات تكوين الأوعية الدموية وتكوين الأوعية الدموية حول معدلات تكوين الأوعية والاختلافات بين الأنماط الهيكلية للشبكة المكونة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح القياس الكمي لأعداد كبيرة من النقاط الزمنية لتكوين الأوعية الدموية ، مما يوفر فرصة لتقييم حركية عملية الأوعية الدموية.

يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي مجموعة من الخلايا أو الحالة المرضية التي تؤثر على عمليات تكوين الأوعية الدموية أو تكوين الأوعية لدراسة مجموعات الخلايا الفردية أو أنظمة الزراعة المشتركة. قبل بدء التجربة بساعة إلى ساعتين تقريبا ، قم بتسخين حاضنة الطمث العلوية للمجهر إلى 37 درجة مئوية ، واضبط ثاني أكسيد الكربون على 5٪ والرطوبة على 85٪ املأ خزان الرطوبة في الحاضنة إذا كان فارغا. ضع حجرة الخلية الحية على المجهر ، ثم ضع شريحة ذات غرفة فارغة في أحد الموضعين المفتوحين داخل حجرة الخلية الحية.

املأ الشريحة بالماء المقطر واضبط منفاخا ثانويا على 39 إلى 42 درجة مئوية لتسخين الشرائح من الأسفل وتقليل التكثيف. يعد الحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة المناسبة داخل غرفة تصوير الخلايا الحية أمرا بالغ الأهمية لنجاح التجربة. أضف شريحة ثانية كشريحة فارغة حتى يمكن إضافة الشريحة التجريبية.

بعد ذلك ، أضف الماء إلى الخزانات المحيطة بالآبار في الشريحة الثانية لتقليد الظروف أثناء تجربة التصوير. لتحميل شريحة الغرفة التجريبية بمصفوفة غشاء القاعد، قم أولا بتحميل ماصة سعة 20 ميكرولتر بطرف ماصة بارد سعة 20 ميكرولتر واستخدم المقص لقطع سنتيمترا واحدا تقريبا من نهاية الحافة. اضبط حجم الماصة على أكبر قليلا من 10 ميكرولتر وشفط المصفوفة ببطء إلى طرف الماصة المعدل.

ضع طرف الماصة على الفور في وسط بئر منزلق واحد، ولمس الطرف برفق إلى قاع البئر، واضغط ببطء على المكبس لدفع المصفوفة للخارج. بعد إضافة مصفوفة إلى جميع الآبار ال 15 ، ادفع الغطاء على طول الطريق على الشريحة. يعد سحب العينة الدقيق والمتسق لأحجام Matrigel في كل بئر أمرا بالغ الأهمية للحصول على صور تباين طور عالية الجودة.

بعد ذلك ، ضع الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة بجوار غطاء أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مملوء بملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من PBS لتقليل الجفاف المصفوفة. عندما تصلب المصفوفة ، قم بإزالة المادة الطافية من ثقافة الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية المزروعة بين عشية وضحاها ، واغسل الخلايا بسبعة ملليلتر من PBS. قم بشفط PBS ، وغسل الخلايا وافصلها بملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا المنفصلة في ثلاثة ملليلتر من Endothelial Growth Medium -2 لتفتيت أي كتل خلوية ونقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بعد إعادة تعليق جميع عينات الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في مل إلى ملليلتر من وسط النمو البطاني الطازج. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة في كل عينة وأضف ما يكفي من الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر للسماح بتخفيف الخلايا إلى 1.4 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل 175 ميكرولتر من التركيز المتوسط.

بعد ذلك ، امزج كل مزيج رئيسي مع ماصة لطيفة. قم بإزالة غطاء الشريحة وتخلي عن 50 ميكرولترا من كل مزيج رئيسي لكل بئر ثلاث نسخ على الشريحة. لتصوير الخلايا ، استبدل الشريحة الفارغة بشريحة تجريبية واحدة وأضف الماء إلى الخزانات المحيطة بالخلايا على الشريحة.

قم بالتنقل عبر كل موضع مرحلة وتأكد من تحديد مركز البئر الأول. ركز على الخلايا المطلية في البئر واضبط الموضع Z للمرحلة. عندما تكون الإعدادات دقيقة، أطفئ الأضواء لبدء تجربة التصوير.

عند اكتمال التصوير، قم بتغيير حجم ملفات مكدس الصور وتصديرها داخل برنامج Image Capture، وحفظ الصور كملفات TIFF لتحليلها. لتحليل الصور ، اسحب ملف التحليل الحركي لتكوين الأوعية الدموية من مجلده إلى الشريط الرمادي أسفل نافذة البرنامج لفتح البرنامج ، وانقر فوق حفظ لإضافة البرنامج إلى القائمة. انقر فوق ملف وفتح لتحديد ملف الصورة المراد فتحه ، أو اسحب ملف الصورة إلى الشريط الرمادي داخل البرنامج.

انقر فوق الصورة والضبط والسطوع/التباين لفتح نافذة السطوع/التباين. انقر فوق إعادة تعيين داخل نافذة السطوع/التباين لتصور الصورة. ثم انقر فوق الصورة والنوع و 8 بت لتحويل الصور إلى 8 بت.

حدد الأدوات وإدارة منطقة الاهتمام، واستخدم أداة تحديد ذات الشكل المناسب لإنشاء منطقة اهتمام جديدة. انقر فوق إضافة لإضافة شكل منطقة الاهتمام إلى نافذة إدارة منطقة الاهتمام وانقر فوق تسمية منطقة الاهتمام في مدير منطقة الاهتمام لعرض المنطقة على الصورة. اضبط منطقة الاهتمام حسب الضرورة.

عندما تكون المنطقة في مكانها، انقر فوق صورة، ثم اقتصاص، لاقتصاص الصورة. بعد ذلك، افتح قائمة التحرير وحدد مسح خارج لحذف بيانات الصورة خارج منطقة الاهتمام لكل صورة في المكدس. بعد ذلك ، افتح قائمة الإضافات وحدد المكون الإضافي تحليل الشبكة.

استخدم سهم القائمة المنسدلة في النافذة المنبثقة لتغيير طريقة العتبة وانقر فوق موافق لبدء معالجة البرنامج. في نهاية التحليل ، سيتم فتح جدول بيانات ومجموعة من الصور المدمجة التي تصور عمليات الترحيل العظمي والقناع. انقر على ملف وحفظ باسم لنقل القيم الرقمية إلى جدول بيانات، واحفظ جدول البيانات الذي يحتوي على قيم البيانات الأولية.

انقر فوق صورة الهيكل العظمي والقناع المدمجة واحفظ مكدس صور الهيكل العظمي المدمجة ومكدس صور تباين الطور الذي تم اقتصاصه كملفات TIFF. ثم انقر فوق نافذة إدارة منطقة الاهتمام ، وحدد منطقة الاهتمام المستخدمة لاقتصاص الصور ، وانقر فوق المزيد ، وحفظ ، لحفظ منطقة الاهتمام لاستخدامها في المستقبل. يتم تمثيل شبكات الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية ، والتي تم تحديدها بواسطة التحليل الحركي لتكوين الأوعية الدموية ، بشكل تصويري على أنها عمليات تسليم للهيكل العظمي والقناع لتوضيح الهياكل المستخدمة من قبل البرنامج للقياس الكمي.

عندما تكون جودة صور تباين الطور عالية ويتم تحقيق تباين كاف ، فإن التحليل الحركي لتكوين الأوعية الدموية سيحدد بدقة شبكات الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية كما يتضح من أوجه التشابه التي لوحظت بين صورة تباين الطور والتحليل الحركي لعمليات الهيكل العظمي والقناع الناتجة عن تكوين الأوعية الدموية. إذا لم تكن صور تباين الطور تحتوي على تباين عال، أو في حالة حدوث عناصر تصوير مثل الشبكة، يتم تقليل دقة اكتشاف الشبكة وتصبح النتائج غامضة. ومع ذلك ، يمكن تحديد طرق عتبة مختلفة ، مثل Mean و Otsu ، الموضحة هنا ، قبل التحليل في القائمة المنسدلة للبرنامج لاستيعاب الاختلافات في جودة الصورة.

استخدام التحليل الحركي لتكوين الأوعية الدموية لتحديد ما إذا كانت الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية المعرضة لسكري الحمل تعرض للحركية المتغيرة لتكوين الشبكة يكشف عن تكوين بنية الشبكة المتغيرة بشكل غير متجانس في مزارع سكري الحمل مقارنة بمزارع الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية من حمل غير معقد. في الواقع ، تشكل عينات الحمل غير المعقدة عادة عددا أكبر من الشبكات المغلقة مقارنة بعينات سكري الحمل. ومع ذلك ، فإن جميع عينات الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية تعرض نمطا ثنائي الطور لتكوين الشبكة بشكل عام ، على الرغم من أن معدلات التكوين والحد الأقصى لعدد الشبكات التي تم تحقيقها تختلف عبر العينات.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن رسم قيم البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة التحليل الحركي لتكوين الأوعية الدموية وتحليلها لتحديد ما إذا كانت هياكل الشبكة التي تشكلها العينات المختلفة مختلفة إحصائيا ، وإذا كان الأمر كذلك ، ففي أي نقاط زمنية. يتيح التحليل الحركي لتكوين الأوعية الدموية المعالجة الفعالة لتجارب الفاصل الزمني التي تتضمن عددا كبيرا من الصور. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال الحصول على الصور ومعالجتها اللاحقة وتحليلها في غضون يومين إذا كانت جميع الأنظمة تعمل بشكل صحيح.