التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في زينوبوس تروبيكاليس
مايو 25, 2017
يوضح هذا البروتوكول طريقة القائم على مضان لتصور الأوعية الدموية وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . الأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد دقائق من حقن صبغة الفلورسنت في قلب الضرب من الجنين بعد التلاعب الجيني و / أو الدوائية لدراسة التنمية القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي .
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور الأوعية الدموية للضفادع الصغيرة Xenopus tropicalis. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا القلب والأوعية الدموية مثل كيفية تنظيم تكوين الأوعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصور الأوعية الدموية في جنين سليم من نوع البئر عن طريق حقن صبغة الفلورسنت البسيطة.
ابدأ باستخدام محمل صغير لملء ماصة زجاجية صغيرة مدببة بحوالي خمسة ميكرولترات من محلول LDL الأسيتيل ثنائي الكثافة الشفاف مع الحرص على عدم تحميل الجسيمات المترسبة. تحت مجهر التشريح ، استخدم زوجا دقيقا من الملقط رقم 55 لقص طرف الماصة لضبط حجم المركب الذي تم تحميله وضبط نظام الحقن الذي يتم التحكم فيه بالضغط لإخراج ما يقرب من خمسة لترات نانو من المحلول لكل حقنة. ثم اغمر طرف الماصة في 0.04٪ MS-222 في محلول ملحي بارث المعدل 0.1X أو MBS في قالب سيلجارد مصنوع خصيصا.
بعد ذلك ، قم بنقل جنين Xenopus tropicalis إلى قالب Sylgard وتأكيد التخدير الكامل مع عدم الاستجابة لتحفيز الزعنفة الظهرية. تحت مجهر التشريح ، قم بتحميل الجانب البطني للجنين لأعلى في المسافة البادئة على شكل حرف V للقالب في وضع مائل قليلا. ضع بإحكام دبابيس دقيقة مقاس 0.1 ملم على حامل دبوس واستخدم دبوسا واحدا لثقب الجلد فوق القلب الذي يجب أن يكون نابضا بشكل واضح.
أدخل الدبوس من خلال الفتحة الموجودة في الفراغ بين القلب والجلد دون ثقب القلب وضع الطرف المدخل داخل المنطقة التي سيتم إجراء الشق فيها. ثم افركي الدبوس الثاني على الدبوس الذي تم إدخاله لعمل شق خطي واستخدم كلا الدبابيس معا لتوسيع الشق برفق ، مما يؤدي إلى تعريض القلب. لحقن محلول LDL الأسيتيل DiI ، أدخل طرف الماصة الزجاجية في القلب وحقن 50 إلى 60 لترا نانو من LDL الأسيتيل DiI في حوالي 10 نبضات طردية.
عندما يتم تسليم كل محلول الصبغة ، تأكد من أن القلب لا يزال ينبض وانقل الجنين إلى طبق بتري جديد يحتوي على 0.1X MBS. بعد خمس إلى 10 دقائق ، يجب أن يتعافى الشرغوف من التخدير ويبدأ في الحركة. بعد حقن عدد مناسب من الأجنة ، قم بفحص الأجنة المخدرة المصنفة بشكل صحيح بصريا تحت المجهر الفلوري للتخلص من أي لها أعضاء أخرى مصنفة.
يمكن حقن الأجنة التي لم يتم تصنيفها بشكل كاف مرة أخرى. ثم التقط صورا للأجنة المسماة بشكل صحيح. للحصول على تصوير أكثر شمولا للأوعية الدموية ، قم بإصلاح الأجنة المخدرة في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء للتصور بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
إذا تم حقن كمية كافية من diI acetylated LDL في القلب ، فيجب أن يكون الوريد الكاردينال الخلفي ، أو PCV ، مرئيا على الفور تحت المجهر الفلوري. تظهر الأوردة الداخلية ، أو ISV ، ظهريا من PCV في موجة أمامية إلى خلفية تبدأ في المرحلة 36 وتنتهي حوالي المرحلة 40 إلى 41 لتصبح متفرعة قليلا حول المرحلة 43. ينمو PCV و ISV في نمط نمطي لتولد الأوعية الدموية يخضع لرقابة تنموية مشددة.
ومن المثير للاهتمام ، أن ضربة قاضية لإشارات TIE-2 بواسطة المورفالينوس المضاد للمعنى يقلل من طول وتعقيد بائعي البرامج المستقلين بينما يؤدي التعبير عن الشكل النشط التأسيسي ل TIE-2 إلى التفرع المفرط لبائعي البرامج المستقلين. يمكن حساب مؤشر تعقيد الوريد لتقييم تعقيد بائعي البرامج المستقلين ويمكن إنشاء المسارات المقدمة لتصور البنية العامة للأوعية الدموية Xenopus tropicalis الجنينية. تم وصف البروتوكول الأصلي لاستخدام Xenopus laevis بواسطة Levin and Colics وقمنا بتكييفه مع Xenopus tropicalis.
بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. قبل هذا الإجراء ، يمكن إجراء التلاعب الجيني والدوائي للإجابة على أسئلة إضافية مثل الجينات ومسارات الإشارات التي تنظم نمو الأوعية الدموية. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تصوير الأوعية الدموية المسماة في سليم في الوقت الفعلي ، مما يوفر أداة قوية للتحقيق في ديناميكيات تطور الأوعية الدموية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حقن diI أسيتيل LDL في قلب الشرغوف Xenopus الاستوائي لتصور الأوعية الدموية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة تعتمد على الفلورة لتصوير الأوعية الدموية وقياس مدى تعقيدها في ضفدع Xenopus tropicalis. وتسمح هذه التقنية بتصوير الأوعية الدموية بعد وقت قصير من حقن صبغة فلورية في قلب الجنين، مما يسهل دراسات تطور الجهاز القلبي الوعائي في الجسم الحي (in vivo).
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا القلب والأوعية الدموية
- تكون الأوعية الدموية
- بيولوجيا التنمية
خلفية علمية
- يُعد Xenopus tropicalis كائناً نموذجياً لدراسة تطور الفقاريات.
- يُعد فهم التطور الوعائي أمراً بالغ الأهمية للحصول على رؤى حول مختلف الأمراض.
- تعزز تقنيات التصوير الفلوري من إمكانية تصور البنى البيولوجية.
- تسمح هذه الطريقة بالمراقبة الآنية للتغيرات الوعائية.
الغرض من الدراسة
- لتصوير الأوعية الدموية في شرغوف Xenopus tropicalis.
- لبحث تنظيم عملية تكوين الأوعية الدموية.
- لتوفير طريقة بسيطة وفعالة لدراسة التطور القلبي الوعائي.
الطرق المستخدمة
- حقن صبغة فلورية في قلب الجنين.
- استخدام أداة تحميل دقيقة (micro loader) وماصة زجاجية دقيقة مستدقة لضمان توصيل دقيق للصبغة.
- تصوير الأوعية الدموية باستخدام مجهر تشريحي.
- تطبيق تدخلات جينية وداروية لدراسة التأثيرات على الأوعية الدموية.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح للأوعية الدموية في الأجنة السليمة.
- قياس كمي لتعقيد الأوعية الدموية تم تحقيقه من خلال التصوير.
- اكتساب رؤى حول ديناميكيات التطور القلبي الوعائي.
- إثبات فعالية طريقة حقن الصبغة الفلورية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة التطور الوعائي.
- يعد التصوير الفلوري أداة قوية للتحليل في الوقت الحقيقي.
- يمكن لهذا النهج أن يسهل المزيد من الأبحاث في علم الأحياء القلبية الوعائية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح هذه الطريقة التصوير المباشر والقياس الكمي للتعقيد الوعائي في نموذج من الفقاريات، مما يدعم التحقق من صحة الأهداف في المراحل المبكرة من مسارات تكوين الأوعية الدموية. ومن خلال توفير قراءات كمية لتبرعم الأوعية وتفرعها، فإنها تسهل الحد من المخاطر الميكانيكية للأهداف الوعائية قبل البدء في حملات تحديد المركبات الرائدة. ويوفر نظام Xenopus tropicalis منصة ذات صلة بالأمراض لتقييم الأنماط الظاهرية لتكوين الأوعية الدموية بثقة تنبؤية في أبحاث القلب والأوعية الدموية قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة بمنظمات تكوين الأوعية الدموية، مثل إشارات TIE-2، من خلال الملاحظة المباشرة لأنماط تبرعم الأوعية.
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل سريعاً لمدة أسبوع واحد لتقييم تأثير الجين أو المسار على التطور الوعائي دون الحاجة إلى نماذج معدلة وراثياً.
- القيمة التنبؤية: تدعم المخرجات القابلة للقياس، مثل مؤشر تعقيد الوريد (Vein Complexity Index)، التقييم الموضوعي لتأثيرات تعديل الهدف لاتخاذ قرارات فرز المحفظة البحثية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج وسمًا وعائيًا معياريًا وقابلًا للتكرار يتوافق مع مسارات التصوير والتحليل اللاحقة.
- المخرجات الكمية: تتيح قياس طول الوريد بين القطعي وتعقيد التفرع كقراءات استجابية للجرعة من أجل فحص المركبات.
- القابلية للتوسع: يدعم إجراء حقن الصبغة والتصوير البسيط التقييم متوسط الإنتاجية للاضطرابات الفارماكولوجية أو الجينية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: ينمذج عملية تكوين الأوعية الدموية النمطية في Xenopus tropicalis، مما يوفر رؤية حول مسارات التطور الوعائي البشري.
- الاستمرارية الترجمية: يربط نتائج الاكتشافات المبكرة بالتحقق قبل السريري من خلال آليات تكوين الأوعية الدموية المحفوظة.
- تقليل المخاطر الآلية: يسمح بالاختبار السريع لمعدلات المسار لتوضيح بيولوجيا الهدف قبل الاستثمار في دراسات النماذج الثديية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشاف المتصلة، بدءاً من اختبار فرضية الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث توفر بيانات عن النمط الظاهري الوعائي التي تدعم اتخاذ قرارات الاستمرار أو التوقف في البرامج التي تركز على تكوين الأوعية الدموية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم توضيح المسارات من خلال ربط الاضطرابات الجينية أو الدوائية بتغييرات قابلة للقياس في البنية الوعائية.
- الفحص: توفر نتائج قابلة للتكرار قائمة على التصوير، وهي مناسبة لتقييم تأثيرات المركبات على التبرعم الوعائي.
- التحليلات: توفر مقاييس كمية لتعقيد الأوعية الدموية، مما يتيح إجراء مقارنة موضوعية بين الظروف التجريبية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تستفيد من آليات تكوين الأوعية الدموية المحفوظة لدعم الاستمرارية من النماذج الجنينية إلى الأنظمة الوعائية للثدييات.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام للتنميط الظاهري الوعائي يمكن تطبيقها عبر مشاريع متعددة تستهدف تكوين الأوعية الدموية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من أهداف تكوين الأوعية الدموية من خلال التصوير الكمي المباشر للشبكات الوعائية.
- القيمة التشغيلية: يوحد معايير التقييم الوعائي عبر حقن صبغة بسيط وتصوير قابل للتكرار، مما يقلل من التباين بين التجارب.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين التخفيف المبكر من مخاطر الأهداف الوعائية، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة من برامج القلب والأوعية الدموية.
- التأثير على المحفظة: يدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لمعدلات تكوين الأوعية الدموية بناءً على النتائج المظهرية الكمية.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في تقنيات الجراحة المجهرية للتعامل مع الأجنة والحقن المجهري القلبي.
- تعتمد على بنية تحتية للمجهر الفلوري لتصوير الأوعية الدموية والتقاط الصور.
- تستلزم توحيد معايير تحديد مراحل تطور الأجنة وتوقيت الحقن لضمان اتساق وسم الأوعية الدموية.
- تنطوي على اعتبارات التكيف عند تعميم النتائج على أنظمة نماذج أخرى أو سياقات ذات صلة بالبشر.
- تشمل القيود العملية الاعتماد على إمكانية الوصول إلى الأجنة والحاجة إلى تحسين دقيق لتركيز الصبغة لتجنب الوسم غير النوعي.
