التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في زينوبوس تروبيكاليس
May 25th, 2017
يوضح هذا البروتوكول طريقة القائم على مضان لتصور الأوعية الدموية وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . الأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد دقائق من حقن صبغة الفلورسنت في قلب الضرب من الجنين بعد التلاعب الجيني و / أو الدوائية لدراسة التنمية القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي .
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور الأوعية الدموية للضفادع الصغيرة Xenopus tropicalis. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا القلب والأوعية الدموية مثل كيفية تنظيم تكوين الأوعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصور الأوعية الدموية في جنين سليم من نوع البئر عن طريق حقن صبغة الفلورسنت البسيطة.
ابدأ باستخدام محمل صغير لملء ماصة زجاجية صغيرة مدببة بحوالي خمسة ميكرولترات من محلول LDL الأسيتيل ثنائي الكثافة الشفاف مع الحرص على عدم تحميل الجسيمات المترسبة. تحت مجهر التشريح ، استخدم زوجا دقيقا من الملقط رقم 55 لقص طرف الماصة لضبط حجم المركب الذي تم تحميله وضبط نظام الحقن الذي يتم التحكم فيه بالضغط لإخراج ما يقرب من خمسة لترات نانو من المحلول لكل حقنة. ثم اغمر طرف الماصة في 0.04٪ MS-222 في محلول ملحي بارث المعدل 0.1X أو MBS في قالب سيلجارد مصنوع خصيصا.
بعد ذلك ، قم بنقل جنين Xenopus tropicalis إلى قالب Sylgard وتأكيد التخدير الكامل مع عدم الاستجابة لتحفيز الزعنفة الظهرية. تحت مجهر التشريح ، قم بتحميل الجانب البطني للجنين لأعلى في المسافة البادئة على شكل حرف V للقالب في وضع مائل قليلا. ضع بإحكام دبابيس دقيقة مقاس 0.1 ملم على حامل دبوس واستخدم دبوسا واحدا لثقب الجلد فوق القلب الذي يجب أن يكون نابضا بشكل واضح.
أدخل الدبوس من خلال الفتحة الموجودة في الفراغ بين القلب والجلد دون ثقب القلب وضع الطرف المدخل داخل المنطقة التي سيتم إجراء الشق فيها. ثم افركي الدبوس الثاني على الدبوس الذي تم إدخاله لعمل شق خطي واستخدم كلا الدبابيس معا لتوسيع الشق برفق ، مما يؤدي إلى تعريض القلب. لحقن محلول LDL الأسيتيل DiI ، أدخل طرف الماصة الزجاجية في القلب وحقن 50 إلى 60 لترا نانو من LDL الأسيتيل DiI في حوالي 10 نبضات طردية.
عندما يتم تسليم كل محلول الصبغة ، تأكد من أن القلب لا يزال ينبض وانقل الجنين إلى طبق بتري جديد يحتوي على 0.1X MBS. بعد خمس إلى 10 دقائق ، يجب أن يتعافى الشرغوف من التخدير ويبدأ في الحركة. بعد حقن عدد مناسب من الأجنة ، قم بفحص الأجنة المخدرة المصنفة بشكل صحيح بصريا تحت المجهر الفلوري للتخلص من أي لها أعضاء أخرى مصنفة.
يمكن حقن الأجنة التي لم يتم تصنيفها بشكل كاف مرة أخرى. ثم التقط صورا للأجنة المسماة بشكل صحيح. للحصول على تصوير أكثر شمولا للأوعية الدموية ، قم بإصلاح الأجنة المخدرة في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء للتصور بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
إذا تم حقن كمية كافية من diI acetylated LDL في القلب ، فيجب أن يكون الوريد الكاردينال الخلفي ، أو PCV ، مرئيا على الفور تحت المجهر الفلوري. تظهر الأوردة الداخلية ، أو ISV ، ظهريا من PCV في موجة أمامية إلى خلفية تبدأ في المرحلة 36 وتنتهي حوالي المرحلة 40 إلى 41 لتصبح متفرعة قليلا حول المرحلة 43. ينمو PCV و ISV في نمط نمطي لتولد الأوعية الدموية يخضع لرقابة تنموية مشددة.
ومن المثير للاهتمام ، أن ضربة قاضية لإشارات TIE-2 بواسطة المورفالينوس المضاد للمعنى يقلل من طول وتعقيد بائعي البرامج المستقلين بينما يؤدي التعبير عن الشكل النشط التأسيسي ل TIE-2 إلى التفرع المفرط لبائعي البرامج المستقلين. يمكن حساب مؤشر تعقيد الوريد لتقييم تعقيد بائعي البرامج المستقلين ويمكن إنشاء المسارات المقدمة لتصور البنية العامة للأوعية الدموية Xenopus tropicalis الجنينية. تم وصف البروتوكول الأصلي لاستخدام Xenopus laevis بواسطة Levin and Colics وقمنا بتكييفه مع Xenopus tropicalis.
بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. قبل هذا الإجراء ، يمكن إجراء التلاعب الجيني والدوائي للإجابة على أسئلة إضافية مثل الجينات ومسارات الإشارات التي تنظم نمو الأوعية الدموية. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تصوير الأوعية الدموية المسماة في سليم في الوقت الفعلي ، مما يوفر أداة قوية للتحقيق في ديناميكيات تطور الأوعية الدموية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حقن diI أسيتيل LDL في قلب الشرغوف Xenopus الاستوائي لتصور الأوعية الدموية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يُظهر هذا البروتوكول طريقة تعتمد على الفلورسنت لتصور الأوعية الدموية وتحديد تعقيدها في Xenopus tropicalis. تتيح التقنية تصوير الأوعية الدموية بعد فترة قصيرة من حقن صبغة فلورية في قلب الجنين، مما يسهل الدراسات على تطور القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا القلب والأوعية الدموية
- تكوين الأوعية
- بيولوجيا التطور
الخلفية
- Xenopus tropicalis هو كائن نموذجي لدراسة تطور الفقاريات.
- فهم تطور الأوعية الدموية ضروري للحصول على رؤى حول الأمراض المختلفة.
- تقنيات التصوير الفلوري تعزز تصور الهياكل البيولوجية.
- تتيح هذه الطريقة مراقبة التغييرات في الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي.
هدف الدراسة
- لتصور الأوعية الدموية في يرقانات Xenopus tropicalis.
- للتحقيق في تنظيم تكوين الأوعية.
- لتوفير طريقة بسيطة وفعالة لدراسة تطور القلب والأوعية الدموية.
الطرق المستخدمة
- حقن صبغة فلورية في قلب الجنين.
- استخدام أداة تحميل دقيقة وأنبوب زجاجي مدبب دقيق لتوصيل الصبغة بدقة.
- تصور الأوعية الدموية تحت مجهر التشريح.
- تطبيق التلاعبات الجينية والدوائية لدراسة التأثيرات على الأوعية الدموية.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح للأوعية الدموية في الأجنة السليمة.
- تحديد كمي لتعقيد الأوعية الدموية الذي تم تحقيقه من خلال التصوير.
- الحصول على رؤى حول ديناميكيات تطور القلب والأوعية الدموية.
- ثبت فعالية طريقة حقن الصبغة الفلورية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة تطور الأوعية الدموية.
- التصوير الفلوري هو أداة قوية للتحليل في الوقت الحقيقي.
- يمكن أن تسهل هذه النهج إجراء مزيد من الأبحاث في بيولوجيا القلب والأوعية الدموية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
