استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

الهدف العام لهذه السلسلة من المقايسات هو التحقيق في وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الأول باستخدام بويضات الفأر. يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال التناسلي البشري ، مثل ما إذا كان هناك استعداد وراثي لاختلال الصيغة الصبغية الأمومي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم بويضات الفئران كنموذج للانقسام الاختزالي للثدييات ، وهو أمر مفيد نظرا لعدم إمكانية الوصول إلى البويضات البشرية لدراسات وظائف الجينات.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قمنا بتسلسل exomes للنساء اللواتي خضعن لعلاجات الإخصاب في المختبر واللاتي لا يمكن تفسير معدلات اختلال الصيغة الصبغية الجنينية لهن من خلال عمر الأم. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم خطوات تحليل الصور وتحديد معلمات التحليل الصارمة هو مفتاح الصرامة والقابلية للتكرار. باستخدام استراتيجية استنساخ تم التحقق من صحتها ، أدخل تسلسل الترميز الكامل للجين المعني في منطقة الاستنساخ المتعددة لناقل النسخ في المختبر.

إحداث الحمض النووي في حالة توليد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة أو عمليات الإدراج والحذف ، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بتحويل الحمض النووي المطفر إلى مضيف بكتيري. استخدم مجموعة لعزل وتنقية البلازميد باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

بعد ذلك ، قم بخطية المنتجات النهائية باستخدام هضم إنزيم التقييد الفردي للحمض النووي المنقى. قم بتنقية المنتج المهضوم باستخدام بروتوكول تنظيف الحمض النووي أو مجموعة أدوات تم التحقق من صحتها. وقم بالتخلص من 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase / DNase.

في المختبر ، قم بنسخ الحمض النووي باستخدام بوليميراز T7 باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. أخيرا ، قم بتنقية ومسح الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase / DNase باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي القائمة على عمود الدوران من مصفوفة السيليكا باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. قسم البويضات إلى مجموعات متساوية للحقن المجهري.

حقن مجموعة واحدة باستخدام mRNA التجريبي والمجموعة الأخرى بالتحكم من النوع البري NPBs أو GFP mRNA. باستخدام جهاز سحب العينات الذي يعمل باليد أو الفم حيث تكون فتحة الماصة الزجاجية أكبر قليلا من قطر البويضة ، انقل البويضات إلى قطرة 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الخالي من الميلرينون في طبق بتري مغطى بزيت معدني عالي الجودة للجنين. بعد ذلك ، قم باحتضان البويضات لمدة سبع ساعات عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للسماح بالنضج الكافي للطور الطوري للانقسام الاختزالي I.بعد الحضانة ، استخدم نفس جهاز الماصة لنقل البويضات إلى طبق استزراع أعضاء البئر المركزي يحتوي على 700 ميكرولتر من وسط تجميع MEM المبرد مسبقا في البئر الأوسط و 500 ميكرولتر من الماء في الحلقة الخارجية.

ضع الطبق على الثلج لمدة سبع دقائق. قم بإصلاح البويضات عن طريق نقلها إلى بئر من صفيحة بقعة زجاجية شفافة تحتوي على 400 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS. احتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد التلوين المناعي ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتصوير البويضات باستخدام هدف 40 إلى 63x على مجهر متحد البؤر. التقط خطوات صغيرة في المستوى Z المحسن لهدف العمل، وقم بتصوير المنطقة بأكملها من عمود الدوران الطوري. لتحديد حالة مرفق الأنابيب الدقيقة الحركية، افتح الصورة أولا عن طريق سحب الملف إلى شريط أدوات ImageJ.

في سلسلة Z المفتوحة ، انتقل إلى القائمة المنسدلة للصورة ، وضمن علامة التبويب الفرعية اللون ، انقر فوق دمج القنوات لجعل جميع القنوات مرئية. من الأهمية بمكان أن يكون المحلل على دراية بنوع الارتباطات بالحركية الممكنة في بويضات الفئران. ستؤثر جودة الصورة بشكل كبير على قدرتك على تحليل هذه البيانات بشكل صحيح.

باستخدام مفتاح التبديل الموجود أسفل الصورة ، تحرك عبر كل شريحة Z وحدد مرفق الأنابيب الدقيقة الحركية. باستخدام نفس جهاز الماصة، انقل البويضات إلى قطرة 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الخالي من الميلرينون تحت الزيت. احتضان البويضات لمدة سبع ساعات للسماح بالنضج الكافي للطور الطوري للانقسام الاختزالي الأول كما كان من قبل.

بعد ذلك ، انقل البويضات إلى طبق زراعة الأعضاء في البئر المركزي يحتوي على 700 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على الموناسترول في البئر الأوسط و 400 ميكرولتر من الماء في الحلقة المحيطة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. اشطف الموناسترول عن طريق نقل البويضات من خلال ثلاث قطرات من 100 ميكرولتر من وسط استزراع CZB.

ثم انقل البويضات إلى طبق جديد لزراعة الأعضاء يحتوي على 700 ميكرولتر من وسط الاستزراع بالإضافة إلى مثبط البروتيازوم في الحلقة المركزية. أضف 400 ميكرولتر من الماء إلى الحلقة الخارجية واحتضنه لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك ، قم بإصلاح البويضات عن طريق نقلها إلى بئر من صفيحة بقعة زجاجية شفافة تحتوي على 400 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهايد في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

قم بتصوير البويضات باستخدام هدف من 40 إلى 63x على مجهر متحد البؤر ، والتقط أقل من خطوة ميكرون واحدة في المستوى Z وتأكد من تصوير المنطقة بأكملها من مغزل الطور الطوري. لتحديد حالة محاذاة الكروموسومات، افتح ملفات الصور باستخدام برنامج التصوير. ثم اسحب الصورة إلى لوحة تحكم ImageJ.

في السلسلة Z المفتوحة، استخدم أداة النقطة لتمييز النقاط في نهاية كل عمود دوران في شريحة Z الخاصة بها عن طريق وضع الأداة فوق عمود الدوران في الصورة والنقر على الصورة. أضف هذه النقاط إلى مدير العائد على الاستثمار بالضغط في نفس الوقت على زر الأوامر والزر T على لوحة المفاتيح. حدد الإحداثيات المحددة لكل موضع من المراكز المحددة عن طريق تمييز النقطة المحددة في مدير عائد الاستثمار والنقر فوق الزر قياس.

سيوفر هذا جدول نتائج يحتوي على إحداثيات X و Y لكل نقطة ، وهي نقاط X1 و Y1 و X1 و Y2 ، على التوالي. بعد ذلك ، حدد إحداثي Z الحقيقي. يتم ذلك عن طريق ضرب رقم شريحة شريحة Z المحددة في المكدس Z الذي تم فيه تحديد عمود المغزل بواسطة سمك المكدس.

ستكون هذه هي نقاط Z1 و Z2 ، على التوالي. حدد طول المغزل باستخدام معادلة نظرية فيثاغورس بإحداثيات X و Y و Z المحددة مسبقا. بعد ذلك ، حدد منطقة منتصف المغزل.

يتم حساب هذا على أنه 1/2 طول المغزل. انقر فوق رمز الخط في شريط أدوات ImageJ وارسم خطا من عمود دوران واحد إلى منطقة منتصف عمود الدوران. سيتم عرض الطول على شريط أدوات ImageJ.

يسمح تحديد معلمات محاذاة الكروموسومات الصارمة بإجراء تحليل كمي قوي ، وهو أمر مهم في قابلية استنساخ البيانات. حدد حالة محاذاة الكروموسوم عن طريق تقييم مسافة الكروموسوم من منطقة منتصف المغزل باستخدام أداة قياس الخط. انقر فوق رمز الخط في شريط أدوات ImageJ ، وارسم خطا من منطقة منتصف المغزل إلى الكروموسوم.

سيتم عرض الطول على شريط أدوات ImageJ. تعتبر الكروموسومات التي يزيد حجمها عن أربعة ميكرونات من المنطقة الوسطى للمغزل غير محاذاة. بعد خضوع البويضات للتلوين المناعي والتصوير ، يمكن تقييم مرفقات حركية الأنابيب الدقيقة الصحيحة.

في المرفق العادي ، يتم إرفاق كل زوج حركية شقيق من ثنائي التكافؤ بالأنابيب الدقيقة للمغزل من أقطاب متقابلة. يمكن ملاحظة ما يصل إلى ثلاثة أنواع مختلفة من المرفقات غير الطبيعية. يحدث أحد الأمثلة على ذلك عندما لا تكون هناك أنابيب دقيقة تلامس الحركية.

بدلا من ذلك ، يمكن أن ترتبط الأنابيب الدقيقة بشكل غير صحيح ، مما ينتج عنه مرفقات تركيبية أو ميروتيلية. تتشكل المرفقات التركيبية مع كلا الزوجين من الحركية الشقيقة المتصلة بالأنابيب الدقيقة المنبعثة من قطب واحد. تحدث المرفقات العصبية عندما يتم ربط الحركية الشقيقة في زوج بقطبين متقابلين.

بعد تعافي البويضات من المحاذاة الخاطئة المستحثة ، يتم تقييم قدرة الكروموسومات على إعادة التنظيم عن طريق التصوير. في هذا المثال ، يعتبر كروموسوم ثنائي التكافؤ منحرفا لأنه يقع على بعد أكثر من أربعة ميكرون من منطقة منتصف المغزل. عند اختيار الاختبار المناسب لتقييم وظيفة متغير الجين ، من المهم أن تتذكر أن المتغيرات الجينية البشرية قيد الدراسة يتم التعبير عنها بشكل مفرط وأن متماثلات الفئران الداخلية قد تحتاج إلى استنفاد في نفس الوقت.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل CRISPR-Cas9 لإنشاء سلالات الفأر المتوافقة مع البشر للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل فهم كيفية تأثير متغير الجين على جودة البويضات والأجنة وما إذا كان يؤثر على الصحة الإنجابية للفرد. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة التناسلية لاستكشاف العوامل المسببة الأخرى لاختلال الصيغة الصبغية الأمومية لدى البشر. يمكن أن يوفر تحديد الجينات تشخيصات قوية وأساسا للدراسات في تصحيح اختلال الصيغة الصبغية

شكرا لك على المشاهدة. حظا سعيدا في تجاربك.