تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال دقة بوليمرات الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي مثل طرق التدقيق اللغوي والتحليل وفي تحديد رقعة إصلاح الحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها محددة للغاية وبسيطة وسريعة وسهلة التنفيذ. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب ما زالوا في تكرار الحمض النووي وقد لا يكون مجال الإصلاح على دراية بأجهزة قياس الطيف الكتلي وتفسير البيانات.

أعتقد أن الأهم هو أن العرض المرئي أمر بالغ الأهمية حيث يمكننا أن نظهر كيف يمكن تكييف قياس الطيف الكتلي المطور تجاريا للتطبيقات السريرية مثل الطفرة والتفويض بشكل ملائم للتدقيق اللغوي للحمض النووي ودراسة الإصلاح. سيظهر الإجراء طلاب الدراسات العليا Rong-Syuan و Kuei-Ching من مختبري. ابدأ هذا الإجراء بإعداد التمهيدي والقالب كما هو موضح في بروتوكول النص.

على سبيل المثال ، استخدم عدم تطابق TG للركيزة P21 مع T28 للتدقيق اللغوي. قم بتخفيف برايمر P21 وقالب T28 إلى 12.5 بيكومول لكل ميكرولتر بالماء. بعد ذلك ، قم بنقل 12 ميكرولترا من البرايمر المخفف و 12 ميكرولترا من القالب المخفف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل.

بعد إغلاق الأنبوب بإحكام ، احتضن الأنبوب لمدة 30 دقيقة في حمام مائي مغطى بدرجة حرارة 65 درجة مئوية. ثم احتضن لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية. وأخيرا ، ضع الأنبوب على الجليد لضمان التلدين المناسب.

إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعقم سعة 1.5 مل ، أضف ثمانية ميكرولترات من مزيج التمهيدي والقالب ، ولترين ميكرولترين من محلول تفاعل التدقيق اللغوي 10x ، وأربعة ميكرولترات من مزيج 4ddNTPs ، وماء يصل إلى 18 ميكرولترا. انقر فوق الأنبوب للخلط. تمييع بوليميراز الحمض النووي في المخزن المؤقت لتفاعل التدقيق اللغوي البارد 1x إلى التركيز المطلوب.

قم بتخزين الإنزيم المخفف على الثلج في جميع الأوقات. قم بتسخين أنبوب الطرد المركزي الصغير مسبقا مع مزيج الركيزة إلى درجة حرارة التفاعل المطلوبة. بعد ذلك ، انقل ميكرولترين من بوليميراز الحمض النووي المخفف إلى خليط الركيزة الدافئ مسبقا ونفض الغبار عن الأنبوب لخلط محتوياته.

بالطرد المركزي للأنابيب بالإنزيم والركيزة لبضع ثوان عند 3200 ضعف الجاذبية في درجة الحرارة المحيطة لتدوير مكونات التفاعلات. انقل التفاعل على الفور إلى كتلة تسخين أو حمام مائي عند درجة حرارة الحضانة المطلوبة. لإنهاء التفاعل ، أضف حجما متساويا من الفينول المخزن وخلط التفاعل عن طريق الدوامة لبضع ثوان.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتفاعل في جهاز طرد مركزي صغير عند 3200 ضعف الجاذبية في درجة الحرارة المحيطة لمدة خمس دقائق. انقل المرحلة المائية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف وأضف حجما متساويا من الكلوروفورم. بعد خلطها عن طريق الدوامة لبضع ثوان ، قم بالطرد المركزي للعينة في جهاز طرد مركزي دقيق عند 3200 مرة من الجاذبية عند درجة الحرارة المحيطة لمدة ثلاث دقائق.

انقل المرحلة المائية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف. بعد احتضان التفاعل عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ضع الأنبوب على الجليد. بعد ذلك ، قم بإجراء إضافة الراتنج للتخلص من تلوث الملح في صفيحة بئر 384 كما هو مفصل في بروتوكول النص.

اضبط لوحات العينة في موزع النانولتر. ضع شريحة المصفوفة ولوحة البئر 384 المحضرة في الدرج المقابل. قم بتشغيل موزع النانو لاكتشاف منتجات التفاعل مع الشريحة.

اضغط على زر التشغيل على شاشة اللمس الخاصة بموزع النانو للبدء. تحقق من الصورة الملتقطة تلقائيا لبقع العينة التي تحتوي على معلومات التشبع على الشاشة للتأكد من أن الحجم الإجمالي المرقط على الشريحة يتراوح بين خمسة إلى 10 نانولترات. كرر اكتشاف العينة إذا كان الحجم غير كاف.

قم بإعداد ملف بتنسيق Excel يحتوي على معلومات الإشارة المتوقعة للاستيراد. قم بإنشاء فحصة جديدة وتعريفها في برنامج التطبيق عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن فوق مجموعة مقايسة الاستيراد بتنسيق المصمم وتحديد ملف Excel. قم بإنشاء لوحة الفحص المستهدفة عبر شجرة خيارات لوحة مشروع العميل على الجانب الأيسر من الشاشة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن فوق الجزء العلوي من الشجرة وإعطائها اسم ملف.

حدد نوع لوحة البئر 384 واضغط على موافق. ستظهر لوحة فارغة. حدد المقايسة المناسبة على الجانب الأيسر من الشاشة. قم بتعيين المقايسة المحددة لكل موضع عينة مرقط على الشريحة عن طريق تمييز البئر والنقر بزر الماوس الأيمن لتحديد إضافة plex.

بعد ذلك ، قم بإعداد قائمة عمل لجميع الاختبارات على الشريحة بتنسيق Excel بدون رأس. قم باستيراد قائمة العمل عبر خيار إضافة نموذج مشروع جديد. قم بتعيين الاختبار وقائمة العمل لكل موضع من مقايسة P21T28 واختر بالنقر بزر الماوس الأيمن.

اربط مطياف الكتلة بالشريحة باستخدام برنامج التطبيق. حدد الإعداد الافتراضي على الجانب الأيسر من الشاشة. املأ اسم الفحص ومعرف الشريحة في زاوية الشريحة.

احفظ الإعدادات وابدأ برنامج التحكم في MS. اضغط على زر الإدخال / الخارج وأخرج لوحة الكشافة. ضع الشريحة المرقطة على لوحة الاستكشاف واضغط على زر الإدخال / الخارج للرقاقة المرقطة لدخول مطياف الكتلة.

انقر فوق الزر "اكتساء" الخاص ببرنامج التطبيق لبدء قياس الطيف الكتلي والحصول على البيانات. افتح البرنامج لتحليل البيانات. تصفح شجرة قاعدة البيانات في الزاوية اليسرى العليا وحدد معرف الشريحة.افتح ملف البيانات على الجانب الأيمن من الشاشة.

انقر فوق رمز الطيف لعرض الطيف الكتلي. لاقتصاص نطاق معين من الكتلة على الشحن، انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد مربع حوار التخصيص. في النافذة الجديدة ، انقر فوق المحور x واضبط الحد العلوي والسفلي المطلوب واضغط على موافق لإظهار النطاق المحدد للطيف.

قم بتصدير الطيف لحفظ السجلات بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق التصدير. حدد نوع ملف JPEG ، وانقر فوق الوجهة ، وحدد قرص التصفح ، واكتب اسم الملف ، ثم انقر فوق تصدير. لتقدير البيانات كمية، استخدم المؤشر وانقر على الذروة لإظهار ارتفاع الذروة في الزاوية اليسرى العليا.

في MALDI-TOF MS هناك علاقة عكسية بين شدة الذروة في كتلة قليل النوكليوتيدات. خضعت قلات النوكليوتيدات من 17 إلى 24 نيوكليوتيد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. تم حساب شدة الإشارة النسبية ويمكن استخدامها للقياس الكمي لمقايسة التدقيق اللغوي أو الإصلاح.

يمكن العثور على كل من إشارات القالب والتمهيدي في الطيف الكتلي. وبسبب الاختلافات في الحجم، كانت الإشارات الصادرة عن القوالب ومنتجات التحلل الجزئي غير المحددة الخاصة بها منفصلة جيدا عن البادئات غير المتطابقة ومنتجات التدقيق اللغوي. يظهر هنا تدقيق لغوي لثلاثة أطراف رئيسية TG.At خمس دقائق ، وكان المنتج المصحح 23٪ مقابل 17٪ لمنتج الاستئصال.

استمر هذا الفرق في الارتفاع إلى 69٪ مقابل 14٪ في 20 دقيقة. لاحظ الدقة العالية ل MS التي تفصل بوضوح بين الإشارات شبه المستقيمة والمنتج بفرق شحن زائد كتلي يبلغ 32 فقط. كما يمكن حلها بسهولة شكلان من منتجات الاستئصال للتدقيق اللغوي النهائي TG.

استئصال النوكليوتيدات الوسيط واثنين من منتجات استئصال النيوكليوتيدات. أظهر التدقيق اللغوي لعدم التطابق الداخلي اتجاها واضحا في كفاءة التدقيق اللغوي. كما يتضح من حديث منتج كبير لغوي ، لوحظت زيادة الكفاءة عندما يكون لدى الخطوط الفرعية عدم تطابق في النيوكليوتيدات الأخيرة وقبل الأخيرة والثالثة والرابعة من الطرف الرئيسي الثلاثة ، مقارنة بعدم التطابق في المواضع الأخرى.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تطبيقات أخرى مثل التدقيق اللغوي البوليمري لاكتشاف واختراع دواء جديد للأبحاث الصيدلانية. تمهد هذه التقنية أيضا الطريق للباحثين في مجال تكرار الحمض النووي وإصلاحه لاكتساب المزيد من التبصر في طب جنوم والنسخ المتماثل المخلص لجميع الكائنات الحية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التدقيق اللغوي للحمض النووي ومقايسة الإصلاح باستخدام تحليل قياس الطيف الكتلي MADI-TOF. لا تنس أن العمل مع كلوروفورم الوتدي يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية ، أثناء تنفيذ الإجراء. ويمكن اعتبار البروتوكول البديل الوارد في النص بديلا أكثر أمانا.