التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التضفير البديل قبل الرنا المرسال. على وجه التحديد ، فإنه يوفر نظام فحص قوي وحساس لفحص أنماط الربط البديلة في الموقع في شرائح الأنسجة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تحليل التضفير البديل في وقت واحد في العديد من الأنواع الفرعية الموجودة في الهياكل البيولوجية المعقدة مثل دماغ الفأر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم مجسات تقاطع exon مضادة للكهرباء الساكنة للصدمات في mRNA في التهجين الموضعي لإنتاج إشارات تهجين محددة متساوية. تزيد تقنية تضخيم إشارة البناء من حساسية الكشف لتوفير إشارات تهجين قوية. كانت الإشارات المكتشفة عبارة عن إدراج exon هروب من مجسات محددة تستخدم لحساب النسبة المئوية لللصق في العناصر الحيوية في مناطق تشريحية مختلفة من دماغ الفأر.

في هذه الدراسة NF1 ، يتم استخدام exon 23a كمثال لتوضيح استخدام نظام الفحص. ومع ذلك ، يمكن تكييف النظام لتحليل أنماط التعبير للعديد من exons البديلة. لبدء البارافينات في قسم دماغ الفأر D ، املأ طبقين للغسيل ب 250 مل من الزيلين.

واثنان آخران مع 250 مل من الإيثانول 100٪ داخل غطاء الدخان. أدخل شرائح المناديل في رف الغسيل. بعد ذلك ، ضع رف الغسيل في طبق يحتوي على الزيلين واحتضنه لمدة خمس دقائق أثناء تحريك الرف لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل وكرر ذلك مع طبق الزيلين الثاني.

ثم ضع الرف في طبق يحتوي على الإيثانول واحتضنه لمدة دقيقتين بنفس الحركات لأعلى ولأسفل ثم كرر ذلك مع طبق الإيثانول الثاني. لتجفيف الشرائح ، حرك الرف من طبق الإيثانول الثاني وضعه داخل حاضنة على حرارة 60 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. استخدم قلم حاجز مسعور لرسم حاجز 0.75 بوصة × 0.75 بوصة حول قسم الأنسجة وجففه في الهواء لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بتشغيل فرن التهجين واضبط درجة الحرارة على 40 درجة مئوية. بعد ترطيب ورق الترطيب تماما بالماء المقطر ، ضعه في صينية للتحكم في الرطوبة. ثم أدخل صينية التحكم في الرطوبة في فرن التهجين.

بعد وضع الشرائح المجففة على مقعد ، قم بتغطية أقسام الأنسجة بالكامل في كل شريحة بخمس إلى ثماني قطرات من محلول بيروكسيد الهيدروجين. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اضغط على الشرائح على ورق ماص ، واحدة تلو الأخرى لإزالة محلول بيروكسيد الهيدروجين وإدخال الشرائح في رف الغسيل.

اغمر الرف في طبق غسيل يحتوي على الماء أثناء تحريكه لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات لغسل الشرائح. املأ دورق زجاجي سعة لتر واحد يوضع على لوح ساخن ب 700 مل من معالجة إزالة الهدف 1X وقم بتغطيته بورق الألمنيوم. أدخل مقياس حرارة من خلال غطاء القصدير وقم بتشغيل اللوح الساخن ، واضبطه على درجة حرارة عالية لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

بمجرد أن تصل درجة حرارة كاشف الاسترجاع إلى 98 درجة مئوية ، اضبط اللوح الساخن على درجة حرارة منخفضة للحفاظ على حالة غليان معتدلة. بعد ذلك ، قم بإزالة ورق القصدير بعناية وضع الرف داخل الدورق غطي الدورق بورق القصدير واحتضنه لمدة 15 دقيقة.

استخدم الملقط لنقل الرف من الدورق إلى طبق غسيل يحتوي على 200 مل من الماء المقطر واحتضانه لمدة 15 ثانية. بعد 15 ثانية ، ضع الرف في طبق غسيل يحتوي على 100٪ من الإيثانول واحتضنه لمدة ثلاث دقائق. أخرج الرف من الطبق وجففه على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد وضع الشرائح على رف البقع ، قم بتغطية أقسام المناديل بخمس قطرات من البروتياز 3 لكل شريحة. ضع الرف بحذر في صينية التحكم في الرطوبة وأدخل الصينية في فرن التهجين واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد إزالة الرف من الدرج ، اضغط على الشرائح لإزالة السوائل الزائدة وإدخالها في رف الغسيل.

ضع الرف في طبق غسيل يحتوي على ماء مقطر وحرك الرف لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات لغسل الشرائح. للتحضير للتهجين في الموقع ، احتضان المجسات وكواشف AMP في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أدخل صينية التحكم في الرطوبة في فرن التهجين واضبطها على 40 درجة مئوية.

لتهجين المسبار ، قم بإزالة الشرائح من رف الغسيل واضغط عليها لإزالة السوائل الزائدة. ضع الشرائح على رف البقع. استخدم قلم رصاص لتسمية الشرائح باسم المسبار.

ضع ثلاث شرائح من أنسجة المخ المقطوعة المجاورة ليتم تهجينها بثلاثة مجسات مختلفة من الألياف العصبية من النوع الأول معا. نظرا لوجود مجسات مختلفة جدا خاصة بالشكل الإسوي ، فأنا أستخدم أقسام الأنسجة المقطوعة بشكل مجاور. من الأهمية بمكان أن يتم التعامل مع هذه الأقسام بنفس الطريقة تماما في خطوات التهجين والتضخيم واكتشاف الإشارة لضمان دقة لصق النسبة المئوية في الحساب.

قم بتغطية أقسام الأنسجة بأربع قطرات من المسبار لكل قسم ، شريحة واحدة في كل مرة لمنع جفاف الأقسام. ثم ضع رف البقع في صينية التحكم في الرطوبة وأدخله في الفرن 40 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك ، ضع رف الغسيل في طبق غسيل مملوء ب 200 مل من مخزن الغسيل 1X.

ثم اضغط على كل شريحة ، واحدة تلو الأخرى على منشفة ورقية لإزالة السوائل الزائدة. وأدخل كل شريحة على الفور في رف الغسيل. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين في طبق مليء بمحلول غسيل طازج أثناء تحريك الرف لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات ثم كرر الغسيل في طبق جديد.

لتضخيم الإشارة ، انقر فوق كل شريحة لإزالة مخزن الغسيل الزائد ووضعها على رف البقع. قم بتغطية قسم المناديل في كل شريحة بأربع قطرات من كاشف AMP الصفر. بعد ذلك ، ضع الرف في صينية التحكم في الرطوبة ، وأدخل الصينية في الفرن واحتضنها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

اغسل الشريحة مرتين باستخدام عازلة الغسيل كما حدث سابقا في هذه التجربة. كرر خطوة تضخيم الإشارة باستخدام كواشف AMP من واحد إلى ستة كما هو موضح في بروتوكول النص واغسل الشرائح بعد كل خطوة. لاكتشاف الإشارة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل الزائد من الشرائح عن طريق النقر عليها ووضعها على رف البقع.

بعد ذلك ، امزج ميكرولترين من الأحمر السريع B مع 120 ميكرولتر من اللون الأحمر السريع A في أنبوب طرد مركزي صغير. أضف المحلول إلى أقسام المناديل في كل شريحة لتغطيتها بالكامل. ضع رف البقع في صينية التحكم في الرطوبة ، وقم بتغطية الدرج واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة المحلول وأدخل الشرائح في رف الغسيل. ضع الرف في طبق غسيل يحتوي على ماء الصنبور لغسل الشرائح وتكرار الغسيل. بعد الغسيل الثاني ، اضغط على ورق ماص لإزالة الماء الزائد.

بعد ذلك ، ضع الرف في طبق يحتوي على محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين بنسبة 50٪. حرك الرف لأعلى ولأسفل عدة مرات. واحتضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

انقل الرف إلى طبق غسيل يحتوي على ماء الصنبور. حرك الرف لأعلى ولأسفل خمس مرات وكرر الغسيل حتى تصبح الشرائح صافية ، بينما تظل أقسام المناديل أرجوانية. ثم انقل الرف إلى طبق يحتوي على 0.02٪ ماء الأمونيا.

حرك الحامل لأعلى ولأسفل مرتين إلى أربع مرات حتى تتحول الأقسام إلى اللون الأزرق. اغسل الشرائح بماء الصنبور ثلاث إلى خمس مرات في طبق التلوين. بعد ذلك ، ضع الرف داخل حاضنة واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 60 درجة مئوية لتجفيف الشرائح.

عندما يجف تماما ، أضف قطرة واحدة من وسط التثبيت على كل شريحة لتغطية الشريحة. بعد ذلك ، ضع بعناية غطاء مقاس 24 × 50 ملم فوق أقسام المناديل في كل شريحة. بعد تجفيف الشرائح بالهواء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تابع جمع البيانات.

لحساب النسبة المئوية المقسمة أو قيمة PSI ل exon 23a ، يتم حساب عدد الخلايا والنقاط في ثلاث مناطق فرعية من القشرة والحصين CA3. يتم إجراء مقايسة تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع في أقسام الدماغ للفئران البرية CD1 باستخدام ثلاثة مجسات مختلفة خاصة ب NF1. تشير النقاط المنقطة الحمراء التي لوحظت في أقسام القشرة والحصين إلى إشارات إيجابية من خلال NF1 الإجمالي ، والتضمين المحدد ، وتخطي مجسات معينة.

ثم يتم حساب إشارات ISH من المجسات الثلاثة واستخدامها لحساب PSI. يتم إجراء فحص تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع في قشرة الفئران البرية C57 السوداء 6J والفئران الطافرة C57 السوداء 6J التي يتم فيها تضمين exon 23a في جميع أنواع الخلايا. تشير النقاط المنقطة الحمراء التي لوحظت في قشرة الفئران البرية السوداء C57 6J ، إلى إشارات إيجابية من خلال إجمالي NF1 ، وتحديد التضمين ، وتخطي مجسات محددة.

في الفئران الطافرة السوداء C57 6J ، يتم الحصول على إشارات مماثلة بواسطة مجسات NF1 الإجمالية والشمولية. ومع ذلك ، لا يتم الكشف عن أي إشارة عند تخطي مسبار معين ، مما يشير إلى أن مسبارا يستهدفان إدراج exon أو تخطيهما محددان للغاية. نظرا لأن الملصقات متعددة الألوان على شرائح الأنسجة نفسها غير متوفرة بعد لهذا الإجراء ، يتم استخدام مجسات مختلفة على شرائح الأنسجة المختلفة.

للحصول على قيم الربط المئوية الدقيقة ، من المهم استخدام الشرائح المقطوعة المجاورة ومعالجة الشرائح بنفس الطريقة بالضبط طوال هذا الإجراء. تكمل هذا الإجراء تدابير مثل الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، التي يمكن إجراؤها للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتوطين ووظيفة الأشكال الإسوية للتضفير المعبر عنها تفاضليا.