تسجيلات إمكانات العمل البصرية الخاصة بالنوع الفرعي في الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من Cardiomyocytes البطين
September 27th, 2018
هنا نقدم طريقة بصريا إمكانات العمل في الصورة، على وجه التحديد في cardiomyocytes البطين مثل المستحثة pluripotent المستمدة من الخلايا الجذعية. الأسلوب الذي يستند إلى التعبير يحركها المروج بروتين فلوري المراعية للجهد.
يتم استخدام خلايا القلب المتولدة من الخلايا الجذعية أو IPS المستحثة متعددة القدرات بشكل متزايد للإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية في مجال الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية. المزايا الرئيسية لهذه التكنولوجيا هي أنها تسمح بزيادة كبيرة في الإنتاجية وكذلك النوع الفرعي تسجيلات محتملة للعمل في البطين مثل myocytes ، وذلك باستخدام عنصر المروج البطينية محددة. إدخال أجهزة استشعار الجهد المشفرة وراثيا من خلال تحويل العدس الفيروسية يسمح التصوير البصري لإمكانات عمل الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان.
تبدأ من خلال خلط خلية تحتوي على فيروس عدس اختلطت مع القلب و القلبية متوسطة الصيانة، بنسبة واحد إلى واحد. يضاف بروميد الهيكساديثيرين بتركيز نهائي يبلغ 8 ميكروغرام لكل ملليلتر، لتعزيز كفاءة العدوى. واستبدال القلبmyocyte المتوسطة الصيانة في طبق ثقافة القلب المشتقة من الخلايا IPS، مع المتوسطة العدوى.
زراعة القلب المصابة لمدة 12 ساعة في 37 درجة مئوية، واستبدال وسط العدوى مع القلب الطازجة وسط الصيانة. قبل التصوير، تبادل متوسطة ثقافة الخلية مع حل التيرود، مع مكملة مع الكالسيوم. ثم ضع عضلة القلب في غرفة التصوير على خشبة مسرح مجهر epifluorescence المقلوب المجهزة بمقسم صورة.
إذا كان هناك حاجة إلى سرعة كهربائية، فقم بتركيب أقطاب سرعة في غرفة التصوير وتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد تحفيز. جلب الخلايا في التركيز، وتحديد موقع خلية تعبر عن مؤشر الجهد المشفرة وراثيا في وسط مجال المشاهدة. تعيين المسار البصري بحيث يتم توجيه الضوء المنبعث إلى مقسم الصورة وتبديل مكعب مرشح في المجهر إلى واحد ليتم دمجها مع المرشحات في مقسم الصورة.
في البرنامج الذي يتحكم في الكاميرا، قم بتعيين إعداد الاكتساب بحيث يكون التصوير عالي السرعة ممكنًا، ثم قم بإعداد مقسم الصور وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. وينبغي أن تكون الصورتان اللتين تمثلان نطاقين مختلفين من الموجات الموجية للانبعاثات متاخمة لكل منهما، وتشغل كل منهما نصف الصورة. فحص وضبط التركيز من الصورة التي تنتجها الكاميرا حسب الضرورة.
وضبط سطوع ضوء الإضاءة بحيث يتم تجنب تشبع بكسل. تعيين اقتناء سلسلة زمنية، وتميم الضوء في الغرفة لتجنب الضوء الضال التي تؤثر على القياس. ثم فتح مصراع ضوء الإثارة والبدء في الحصول على سلسلة الصور ، بدءا من سرعة الكهربائية في الوقت المناسب ، كما هو مناسب تجريبيا.
عند الانتهاء من عملية الاستحواذ، أغلق مصراع ضوء الإثارة حسب الضرورة واحفظ التسجيل على القرص الصلب. ثم، ترك إعداد التسجيل دون تغيير، تسجيل الخلفية على منطقة من الغطاء بدون خلايا. لتحليل التسجيلات المحتملة للغشاء البصري ، افتح كومة tiff التي تحتوي على الخلايا في ImageJ ، واستخدم أداة الاختيار الحر لرسم منطقة ذات أهمية على عضلة القلب الفلورية ، في القناة الحمراء ، مع الحرص على أن المنطقة كبيرة بما يكفي أن الخلية لن تنتقل من المنطقة أثناء التعاقد.
بعد ذلك، حدد تحليل، أدوات، إدارة منطقة الاهتمام وحدد إضافة T، لإضافة المنطقة كمنطقة ذات فائدة 1. اسحب المنطقة ذات الاهتمام على نفس الخلية في القناة الخضراء، ثم أضف هذه المنطقة كمنطقة الاهتمام 2. ضمن القوائم تحليل و تعيين القياسات، قم بإلغاء تحديد كافة الخيارات باستثناء قيمة متوسط الرمادي.
في إدارة منطقة الاهتمام، انقر فوق أكثر و متعدد قياس لتحديد خيارات قياس كافة الشرائح و صف واحد لكل شريحة ثم انقر فوق موافق. سيتم فتح إطار يحتوي على جدول بيانات يحتوي على الصفوف الثلاثة. استخدم ملف وحفظ باسم لحفظ جدول البيانات في ملف قيمة مفصولة بفاصلة. إغلاق الإطار مع مكدس الصور و إطار جدول البيانات دون إغلاق الإطار إدارة منطقة الاهتمام ثم فتح مكدس tiff يحتوي على قياس الخلفية.
في إدارة منطقة الاهتمام، انقر فوق "قياس أكثر ومتعددة" لتحديد خيارات قياس كافة الشرائح و صف واحد لكل شريحة ثم انقر فوق موافق. ثم احفظ بيانات الخلفية في ملف CSV منفصل. هنا، يتم تصوير القلب القلبي العضلي القلبي المشتق من الخلايا المفردة التي ينبثقها IPS مع الخطوط البيضاء المنقطة التي تشير إلى المناطق ذات الاهتمام، ويتم رسمها أثناء تحليل التصوير في قنوات تقديم العروض والقنوات GFP. توضح الإشارة من قناة RFP زيادة دورية في كثافة الفلورسنت خلال كل عمل محتمل بسبب زيادة نقل الطاقة القسري أو الرنين الناجم عن التغيرات في إمكانات الغشاء.
ومن الناحية التطابقية، تظهر إشارة GFP انخفاضاً دورياً في كثافة الفلورسنت. نسبة عروض تقديم العروض إلى برنامج المنح هو الإشارة البيولوجية المستخدمة في التحليلات النهائية، مثل قياس المدة المحتملة لـ 50 و90. على سبيل المثال، باستخدام هذه الطريقة، البطين القديم 30 يوما مثل خلايا القلب المشتقة من الخلايا IPS وضعت في 0.5 هيرتز، وأظهرت متوسط مدة العمل المحتملة 50 من 439 مللي ثانية، ومتوسط مدة الإجراء المحتملة 90 من 520 مللي ثانية.
التحفيز الكهربائي للقلب الخلايا المشتقة من IPS في زيادة معدلات التحفيز كل خمس ضربات ، أظهر تقصيرًا تدريجيًا لإمكانات العمل مع زيادة معدل الضرب. وعلاوة على ذلك, العلاج من الضرب التلقائي IPS الخلايا المشتقة من القلب مع isoproternol, غير انتقائية بيتا أدرينو مستقبلات ناهض, أدى إلى زيادة فورية في معدل الضرب, التي يمكن زيادة مع زيادة جرعات من ناهض. في حين أن هذه الطريقة توفر إنتاجية متفوقة مقارنة بالقياسات الفسيولوجية الكهربائية الكلاسيكية ، يجب على المرء أن يكون على بينة من حدودها ، بما في ذلك دقة زمنية محدودة من الخصائص الحركية الجوهرية لمستشعر الجهد الفلوري.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة للتصوير الضوئي لإمكانات الفعل في خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة والمتمايزة بشكل يشبه البطين. تستخدم التقنية بروتينًا فلورسنتًا حساسًا للجهد يتم التعبير عنه من خلال نهج مدفوع بالمروِّج.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكهربية القلبية
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- تقنيات التصوير الضوئي
الخلفية
- تُستخدم الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (IPS) لتوليد خلايا عضلة القلب.
- تعزز هذه التقنية الإنتاجية لتسجيلات إمكانات الفعل.
- تُمكِّن عناصر المروج الخاصة بالبطين الدراسات المحددة للنويع.
- تسهل المستشعرات الجهدية المشفرة وراثيًا التصوير الضوئي لإمكانات الفعل.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لتصوير إمكانات الفعل في خلايا عضلة القلب.
- تحسين فهم الكهربية القلبية.
- استخدام خلايا عضلة القلب المشتقة من IPS في التطبيقات البحثية.
الطرق المستخدمة
- استخدام التوصيل اللينتيفيروسي لإدخال المستشعرات الجهدية المشفرة وراثيًا.
- خلط اللينتيفيروس مع وسط صيانة خلايا عضلة القلب.
- استخدام بروميد الهكساديميثرين لتعزيز كفاءة الإصابة.
- استبدال وسط الثقافة بوسط الإصابة للخلايا المستحثة من اللينتيفيروس.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح لإمكانات الفعل في خلايا عضلة القلب.
- زيادة الإنتاجية المثبتة للدراسات الكهربية الفسيولوجية.
- تمكين تسجيلات محددة للنويع باستخدام التعبير المدفوع بالمروِّج.
- التحقق من استخدام المستشعرات المشفرة وراثيًا في التصوير الحي للخلايا.
الخلاصات
- توفر الطريقة أداة قوية لدراسة الكهربية القلبية.
- تعزز فهم إمكانات الفعل في خلايا عضلة القلب البشرية.
- يمكن تطبيق هذه النهج على أسئلة بيولوجية مختلفة في أبحاث القلب.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Subtype-specific optical action potential recording in human iPSC-derived ventricular cardiomyocytes addresses a key challenge in cardiac safety pharmacology: phenotypic heterogeneity obscuring target engagement signals. By enabling ventricular-selective measurements, this method improves predictive confidence in early-stage electrophysiology screening and supports mechanistic de-risking of ion channel modulators. It positions ventricular-like iPSC-CMs as a disease-relevant system for lead identification and preclinical model validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in ventricular-like cardiomyocytes by isolating action potential signals from atrial/nodal contaminants.
- Operational Value: Supports biological de-risking of ion channel targets through promoter-driven, subtype-specific voltage sensor expression.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking optical readouts to ventricular-specific electrophysiological phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces ventricular-specific optical membrane potential recordings compatible with time-lapse fluorescence microscopy for compound screening.
- Quantitative Output: Enables action potential duration 50 and 90 measurements from RFP/GFP ratio changes, providing scalable electrophysiological endpoints.
- Reproducibility: Lentiviral transduction with ventricular promoter ensures consistent sensor expression across batches, supporting assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Ventricular-like iPSC-CMs model human ventricular electrophysiology, enabling translational biomarker alignment for arrhythmia risk assessment.
- Preclinical Continuity: Optical action potential recordings bridge discovery-phase target validation with preclinical safety evaluation of cardiac liabilities.
- Risk-Adjusted Advancement: Rate-dependent action potential shortening and isoproterenol response data support go/no-go decisions based on physiological relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical cardiotoxicity assessment, providing ventricular-specific electrophysiological readouts that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating ventricular action potentials from mixed iPSC-CM populations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible optical signals with quantitative duration metrics for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates RFP/GFP ratio-based time series enabling action potential duration and rate-response analysis for comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects ventricular-specific optical recordings to preclinical continuity through human-relevant electrophysiological phenotypes.
- Enterprise Reuse: Lentiviral ventricular promoter construct establishes a reusable platform for subtype-specific cardiac electrophysiology screening across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity from phenotypic heterogeneity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of ventricular-specific optical recordings.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cardiac programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on ventricular-selective electrophysiological profiles.
Implementation Considerations
- Required expertise in lentiviral transduction, fluorescence microscopy, and iPSC-CM culture.
- Instrumentation needs include inverted epifluorescence microscope with image splitter and high-speed camera capability.
- Cross-team standardization requires consistent promoter-driven sensor expression and infection efficiency protocols.
- Adaptation considerations include promoter specificity validation across iPSC lines and differentiation batches.
- Practical limitations include temporal resolution constrained by fluorescent voltage sensor kinetics, as noted in source.
