المجهر الإلكتروني الارتباطية الخفيفة (كليم) لتتبع وتصوير البروتينات الفيروسية المرتبطة الهياكل في الخلايا المعطل تداولها البرد
سبتمبر 7, 2018
يتم تطبيق أسلوب ستتحقق خفيفة الميكروسكوب الإلكتروني (كليم) للصورة التي يسببها فيروس هياكل داخل الخلية عبر الميكروسكوب الإلكتروني (م) في الخلايا التي تم تحديدها سابقا عن طريق الخفيفة الميكروسكوب (LM). وضم كنهج تصوير هجين لتحقيق رؤية متكاملة للفيروس--المضيف التفاعلات LM وم.
تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء حول كيفية قيام البروتينات الحيوية الموجودة في الأغشية الخلوية بإنشاء بيئات تفضل النسخ المتماثل الحيوي والتجميع. حجر الزاوية التقني اللذان تم دمجهما هنا هما أولا ، العلاقة بين تصوير الخلايا الحية والفحص المجهري الإلكتروني ، وثانيا ، التجميد بالضغط العالي. على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم تصميمها واستخدامها بنجاح لمعالجة تفاعلات مصدر الفيروس ، إلا أنه يمكن تعميمها بسهولة على مجموعة من التطبيقات في بيولوجيا الخلية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية نظرا لوجود العديد من الخطوات التي تتطلب خبرة عملية مع النجاح ، وخاصة الشلل بالتبريد عن طريق التجميد بالضغط العالي والخطوات اللاحقة. ابدأ بوضع أقراص الياقوت المزخرفة بنمط أبجدي رقمي محفور على أحد أسطحها في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مليلتر ، وغسل الأقراص جيدا بالإيثانول. ضع أقراص الياقوت المغسولة في طبق بتري مبطن بورق الترشيح للتجفيف ، واستخدم ملاقط طويلة ونحيفة لنقل أقراص الياقوت المجففة على شرائح زجاجية. باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 4x ، تأكد من أن نمط الإحداثيات على كل قرص من الياقوت قابل للقراءة. ثم قم بتعقيم الأقراص باستخدام الوصلة المتشابكة بالأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق. في خزانة السلامة الحيوية ، أضف نصف وسط زراعة الخلايا إلى طبق زراعة الخلايا ، واستخدم ملاقط طويلة لنقل أقراص الياقوت بعناية إلى الطبق. ثم ، البذور 1x10
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة المجهر الإلكتروني الضوئي الارتباطي (CLEM) لتصوير البنى داخل الخلوية التي يحفزها الفيروس. ومن خلال دمج المجهر الضوئي (LM) والمجهر الإلكتروني (EM)، يمكن للباحثين اكتساب رؤى حول التفاعلات بين الفيروس والعائل.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات المجهرية
- التفاعلات بين الفيروس والمضيف
خلفية علمية
- تجمع هذه الطريقة بين تصوير الخلايا الحية والمجهر الإلكتروني.
- يعد التجميد عالي الضغط مكوناً أساسياً في هذه التقنية.
- لقد تم تطبيقها بنجاح لدراسة التفاعلات الفيروسية.
- يمكن تعميم هذه الطريقة على تطبيقات متنوعة في بيولوجيا الخلية.
الغرض من الدراسة
- لتصوير الهياكل التي يحفزها الفيروس في الخلايا.
- لتعزيز فهم التفاعلات البروتينية الحيوية في الأغشية الخلوية.
- لتوفير دليل عملي للباحثين الذين يستخدمون هذه الطريقة.
الطرق المستخدمة
- تحضير أقراص الياقوت المنقوشة للتصوير.
- استخدام المجهر المقلوب لتأكيد النمط.
- تعقيم الأقراص باستخدام التشبيك بالأشعة فوق البنفسجية.
- تقنيات زراعة الخلايا لاستزراع الخلايا على أقراص الياقوت.
النتائج الرئيسية
- التصور الناجح للبنى داخل الخلوية المستحثة بالفيروس.
- إثبات فعالية مجهرية الضوء والإلكترون المترابطة (CLEM) في دراسة التفاعلات بين الفيروس والمضيف.
- تحديد الخطوات العملية اللازمة لتنفيذ هذه الطريقة.
- التطبيقات المحتملة في سياقات أوسع لبيولوجيا الخلية.
الاستنتاجات
- توفر طريقة CLEM رؤى قيمة حول بيولوجيا الفيروسات.
- وهي تسد الفجوة بين المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني.
- يُوصى بالتوسع في تطبيقاتها في بيولوجيا الخلية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج المجهر الضوئي الإلكتروني المترابط (CLEM) عقبة حرجة في أبحاث علم الفيروسات من خلال تمكين التحليل المستهدف لمجموعات الخلايا النادرة المنقولة أو المصابة. ومن خلال الجمع بين التصوير الحي للخلايا القائم على الفلورة والحفاظ على البنية الدقيقة عالية الدقة عبر التجميد عالي الضغط، تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في الدراسات الميكانيكية للتفاعلات بين الفيروس والمضيف. كما تدعم هذه الطريقة التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة وتطوير المقايسات من خلال توفير بيانات مترابطة تربط بين الأنماط الظاهرية الوظيفية والبنية تحت الخلوية، مما يوجه قرارات المضي قدماً أو التوقف في مسارات اكتشاف مضادات الفيروسات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط تعبير البروتين الفيروسي المسمى بفلورية بالتغيرات البنيوية الدقيقة في الخلايا المثبتة بالتبريد.
- القيمة التشغيلية: تزيد من الكفاءة في دراسة عمليات عفن أو عدوى منخفضة الكفاءة من خلال الفحص المسبق بواسطة المجهر الضوئي.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر الميكانيكية عن طريق تصور التغيرات الغشائية التي يحفزها الفيروس ومواقع التجميع ذات الصلة بمعقدات التضاعف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج قراءات مترابطة للفلورة والكثافة الإلكترونية، مما يتيح التقييم الكمي لتمركز البروتين الفيروسي والاضطرابات الهيكلية.
- القيمة التشغيلية: يعمل على توحيد تحضير العينات باستخدام أقراص الياقوت المنقوشة، مما يسهل تحقيق ترابط قابل للتكرار عبر التجارب والمستخدمين المختلفين.
- جاهزية المقايسة: يُنتج عينات محفوظة بدقة فائقة (ultrastructurally preserved) تكون مناسبة للتصوير اللاحق والتحليل المورفومتري في حملات الفرز.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: يحافظ على الدقة الهيكلية بدءاً من تصوير الخلايا الحية وصولاً إلى المجهر الإلكتروني، مما يدعم الفحص المظهري المتوافق مع المؤشرات الحيوية في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض.
- النمذجة قبل السريرية: يتيح توصيفاً دقيقاً للتأثيرات المرضية الخلوية الناجمة عن الفيروسات في حالات قريبة من الحالة الطبيعية، مما يعزز الثقة في الاستقراء الانتقالي.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يوفر أدلة هيكلية دقيقة لدعم أو دحض آليات العمل للمرشحات المضادة للفيروسات.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يندرج مجهر الارتباط الإلكتروني الضوئي (CLEM) ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من صياغة الفرضيات في علم الفيروسات المبكر وصولاً إلى التحقق الميكانيكي في مرحلة تحسين الرائد، خاصة عندما تكون هناك حاجة إلى الارتباطات الهيكلية لوظيفة البروتين.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال تمكين التصوير المباشر للهياكل المرتبطة بالبروتين الفيروسي في مجموعات فرعية خلوية محددة.
- الفحص: يعزز موثوقية المقايسات من خلال توحيد التوطين الخلوي والحفظ بالتجميد، مما يقلل من التباين في القراءات الهيكلية.
- التحليلات: يوفر مجموعات بيانات مترابطة من المجهر الضوئي والإلكتروني تسمح بالمقارنة الكمية بين الظروف بناءً على شدة الفلورة والميزات البنيوية الدقيقة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بين التصوير الوظيفي والبيانات الهيكلية عالية الدقة، مما يدعم الاستمرارية من المقايسات القائمة على الخلايا إلى التحقق الميكانيكي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لمنصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة التفاعلات بين الفيروس والمضيف، والتي يمكن تطبيقها على أهداف وعائلات فيروسية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال تقديم أدلة ارتباطية مباشرة على تموضع البروتين الفيروسي والتغيرات الهيكلية المستحدثة.
- القيمة التشغيلية: يحسن إمكانية التكرار من خلال الاستخدام الموحد للركائز المنقوشة والتجميد عالي الضغط، مما يقلل من الشوائب الناتجة عن التثبيت الكيميائي.
- القيمة الاستراتيجية: يساهم في اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف من خلال التحقق من ارتباط الهدف على المستوى البنيوي الدقيق، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة.
- تأثير المحفظة: يتيح ترتيب أولويات المرشحين لمضادات الفيروسات بناءً على المخاطر المعدلة، استناداً إلى التأثيرات المؤكدة على مقصورات التضاعف الفيروسي أو مواقع التجميع.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التصوير الفلوري للخلايا الحية، والتجميد عالي الضغط، والاستبدال بالتجميد، والمجهر الإلكتروني النافذ.
- يعتمد على توفر أجهزة التجميد عالي الضغط، وأجهزة المقطع الدقيق (ultramicrotomes)، وأنظمة التصوير المجهري الضوئي والإلكتروني المترابط.
- يستلزم توحيد العلامات المرجعية (على سبيل المثال، أقراص الياقوت المنقوشة) وبروتوكولات رسم الخرائط الإحداثية بين الفرق البحثية.
- قد يتطلب التكيف مع أنواع مختلفة من الخلايا أو الأنظمة الفيروسية تحسين كفاءة تعداء الخلايا (transfection)، والوسم الفلوري، ومعايير التجميد.
- تشمل القيود العملية انخفاض الإنتاجية بسبب المعدات المتخصصة والحاجة إلى محاذاة البرمجيات الترابطية، كما ورد في المادة المصدرية.
الأسئلة الشائعة حول المستحضرات الصيدلانية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
