خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فحص الأدوية ، مثل توضيح تأثير مثبطات الجزيئات الصغيرة على تركيزات منخفضة جدا لتفاعلات البروتين والبروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها خالية من المعايرة ، ويمكن تنفيذها في أي مجهر متحد البؤر ، وتستخدم كميات صغيرة جدا من البروتينات المصنفة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تطوير أدوية السرطان ومثبطات الجزيئات الصغيرة ومثبطات الاندماج المختلفة لأنها توفر معلومات كمية عن تفاعلات البروتين والبروتين.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتفاعلات البروتين وتجميعاته في المختبر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل ديناميكيات بروتين الخلية الحية وتفاعلات الخلية الخلوية. للبدء ، قم بتحويل خلايا pLysS باستخدام متجه pET-22b يحتوي على علامات FKBP12 البشرية الأحادية و His6 و mVenus البشرية. بعد أن تتعافى الخلايا من التحضين والصدمة الحرارية ، قم بوضعها على LB أجار مكمل بالمضادات الحيوية.

انقل المستعمرات المحولة إلى ثقافة بداية 100 مل LB ، وتنمو لمدة 16 إلى 20 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الرج. بعد الحضانة ، قم بتخفيف ثقافة البداية الكثيفة من واحد إلى 100 في وسط رطل على دفعتين سعة 500 ملليلتر. بعد ذلك ، تنمو لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.6 إلى 0.8.

بعد تبريد المزارع على الجليد ، قم بتحفيز إنتاج البروتين باستخدام IPTG 250 ميكرومولار. قم بزراعة الثقافات لمدة 16 إلى 20 ساعة عند 21 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. ثم ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 2 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة.

قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 40 مل من المخزن المؤقت IMAC A المكملة بمثبطات البروتياز الخالية من EDTA. الآن ، صوتنة الخلايا عند 500 واط ، 20 كيلو هرتز ، و 40٪ سعة في تسع ثوان ، و 11 ثانية لمدة 15 دقيقة على الجليد. بعد الصوتنة ، حصاد المواد القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 20،000 غرام لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية.

انقل المحلل القابل للذوبان إلى قارورة مخروطية الشكل ، وأضف ملليلترين من راتنج TALON. اسمح للتعليق بالتحتضن لمدة ساعة واحدة مع دوران 105 دورة في الدقيقة. الآن ، قم بحصاد الراتنج ، واغسله ب 250 مل من المخزن المؤقت IMAC A متبوعا ب 500 مل من البروتين المخزن المؤقت IMAC B.Elute His6-tagged باستخدام المخزن المؤقت IMAC C. قم بحقن الشطف على عمود استبعاد الحجم المتوازن مسبقا ، واجمع ذروة FKBP12 ، التي تمحى عند حوالي 87.7 ملليلترا.

قم بتقييم نقاء البروتين عبر SDS-PAGE ، وقم بتجميع وتركيزه حسب الحاجة. لإعداد مصفوفة الألواح متعددة الآبار ، قم أولا بإعداد محلول FKBP12 منقى 100 نانومولار في نفس المخزن المؤقت المستخدم في كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. صوتيا وأجهزة الطرد المركزي مع دوران سريع يبلغ 13 ، 000 دورة في الدقيقة لمنع تكوين الركام

الآن ، قم بإدخال 100 إلى 200 ميكرولتر من البروتين المخفف في غرفة مراقبة مكونة من ثمانية آبار ذات قاع زجاجي. أضف ثنائي الميكروبيد BB إلى التركيزات النهائية 10 و 20 و 40 و 80 و 100 و 150 و 300 و 500 نانو مولار. كمرجع ، قم بإعداد محلول 100 نانومولار mVenus وحده لتقييم تأثيرات التجميع وهطول الأمطار المحتملة واستعادة قيمة السطوع للمونومر بنفس إعدادات الاستحواذ.

يمكن استخدام أي نظام متحد البؤر لمجهر المسح الضوئي المجهز بكاشفات رقمية أو كاشفات تناظرية مميزة جيدا وقادرة على الحفاظ على وقت مكوث ثابت لكل بكسل تم الحصول عليه. حدد هدف الغمر في الماء لتصحيح الياقة المصمم للتحليل الطيفي لارتباط الفلورة. الآن ، أضف قطرة ماء إلى هدف الغمر في الماء لتصحيح الياقة.

قم بتركيب غرفة المراقبة المكونة من ثمانية آبار في المسرح. اضبط مسار شعاع الإثارة عن طريق تشغيل الليزر 514 نانومتر وضبطه على طاقة 20 إلى 100 نانووات عند الخروج من الهدف. قم بتشغيل كاشف HyD واحد.

يفضل استخدام أجهزة الكشف القادرة على عد الفوتونات. حدد نافذة الانبعاث من 520 إلى 560 نانومتر. بالنسبة لوضع الاكتساب ، استخدم 16 × 16 بكسل.

اضبط وقت سكون البكسل بحيث يكون وقت الإطار أطول من انتشار البروتين ويكون وقت سكون البكسل أقصر بكثير. يتوافق هذا مع ضبط وقت السكون على حوالي 13 ميكروثانية للنظام المستخدم في هذا العرض التوضيحي. اضبط الثقب في وحدة Airy واحدة للانبعاث المقابل البالغ حوالي 545 نانومتر.

حدد وضع اكتساب الوقت xy ، وحدد عدد الإطارات التي سيتم الحصول عليها لكل عملية استحواذ وبئر. الآن ، اضبط حجم البكسل على حوالي 120 نانومتر. إذا كان النظام مزودا بوضع عالي الإنتاجية ، فأدخل إحداثيات كل بئر وعدد عمليات الاستحواذ لكل بئر لأتمتة العملية.

إذا كان النظام مزودا بنظام التروية ، فقم بتحميل محلول BB وقم ببرمجة التروية لتبدأ مباشرة بعد الإطار 5 ، 000 لتقييم حركية التضليل أثناء الحصول على 10 ، 000 صورة. حدد البئر الصحيح ، وركز على الحل. بعد ذلك ، ابدأ عملية الاستحواذ ، واحفظ مجموعة الصور الناتجة بتنسيق TIFF.

تم الحصول على تسلسلات من 20،000 صورة من FKBP12 mVenus المنقى في محلول 100 نانومتر كما هو محدد في قسم البروتوكول. يتم عرض شدة الإطار الأول مع متوسط الكثافة للصورة التي تم تغيير اتجاهها. يظهر أيضا السطوع بدون التصفية السلسة.

بعد الحصول على 10 ، 000 إطار ، تمت إضافة عقار المجانس BB إلى المحلول أثناء الاستحواذ. تم تحليل كل سلسلة متتالية من 5 ، 000 إطار. كان متوسط السطوع بعد خمس دقائق من إضافة BB هو 1.010 ، وهي زيادة مضاعفة ، مما يشير إلى ثنائي FKBP12.

تظهر حركية العملية تأخيرا بين إضافة BB وثنائي FKBP12 الكامل لمدة دقيقتين تقريبا. أحد الجوانب الرئيسية لتقييم تفاعلات البروتين والبروتين في المختبر هو إنتاج وتنقية البروتين المسمى. تأكد من أن لديك كميات صغيرة من البروتين المسمى ذي الأهمية وأن البروتين الخاص بك لا يتجمع وفقا لتحليلك.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل رنين البلازمون السطحي أو التحليل الطيفي لارتباط التألق من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ثوابت التفكك أو معاملات الانتشار. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفيزياء الحيوية لاستكشاف تفاعلات البروتين والبروتين بالتفصيل في الخلايا الحية. لا تنس أن العمل مع الكواشف لتنقية البروتين يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل نظارات السلامة والقفازات ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.