تركيب وتوصيف وتطبيق مسابر نانوية لأكسيد الحديد فائق المغناطيسية للكشف عن السل خارج الرئة

على الصعيد العالمي، غالباً ما يتأخر تشخيص السل خارج الرئة، لأنه يتطلب تدخلاً جراحياً للتأكيد بسبب العرض السريري غير المحدد والأداء الضعيف في الاختبارات التشخيصية. لتحسين الاختبارات التشخيصية المصلية لمستضدات السل الميكوبتريا، قمنا بتطوير أكسيد الحديد النانوي فائقة المغناطيس للكشف عن السل خارج الرئة. يمكن أن توفر البروتينات النانوية TB-SPIO صور الرنين المغناطيسي الدقيقة بتركيزات منخفضة بسبب خصائصها شبه المغناطيسية دون تحفيز أي استجابة مناعية.

تمكن البروتروبات النانوية TB-SPIO من استهداف الكشف عن عدوى السل الميكوبتريا. ويمكن أيضا أن تطبق كعامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف عن الأمراض الأخرى. تأكد من دراسة البروتوكول بعناية قبل محاولة البروتوكول ، حيث أن كل جزء من التجربة يستخدم تقنية أساسية محددة.

يمكن أن يساعد البرهان البصري للأسلوب التلاميذ على فهم كيفية تنفيذ العملية ، خاصة بالنسبة لبعض التجارب الأكثر تعقيدًا. لإعداد جسيمات نانوية مغناطيسية من أكسيد الحديد المغلفة بالدكستران، الجمع بقوة بين خمسة ملليلترات من ديكستران T40 مع 45 ملليغرام كلوريد الحديدييد مائي و32 ملليغرام من محلول رباعي هيدرويت كلوريد الحديد في درجة حرارة الغرفة. إضافة بسرعة 10 ملليلتر من هيدروكسيد الأمونيوم واستخدام شريط ضجة لتحريك التعليق الأسود الناتج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الاحتضان اثارة، الطرد المركزي الحل وإزالة المجاميع. لفصل منتجات SPIO النهائية من dextran T40 غير المنضمة ، قم بتحميل خليط التفاعل الخماسي المليلتر بأكمله في عمود كروماتوغرافي هلامية يبلغ 2.5 في 33 سنتيمترًا وينلت الدكستران مع 0.1-molar من خلات الصوديوم و0.15-molar من محلول عازل كلوريد الصوديوم. ثم، وجمع جسيمات نانوية المغناطيسي أكسيد دكستران المغلفة منقّحاة الحديد في حجم الفراغ ومقايسة العمود يذرى للحديد والدكستران في 330 و 490 نانومتر وفقا للبروتوكولات القياسية.

لإنشاء الأجسام المضادة السطحية لسطح الداء المتقارنة بين MYCOBACTERIUM، قم أولاً بتوليف أنهيدريد SPIO-EDBE-succinic عن طريق خلط 10 ملليلترات من محلول قلوي من الإثير الإثير الثنائي الفينيل متعدد البروم ثنائي الفينيل SPIO-EBDE مع غرام واحد من أنهيدريد كسينك لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، واستخدام 12،000 إلى 4،000 الوزن الجزيئي قطع أنابيب الغشاء المسامية الجزيئية لs dialyze الحل مع التغيرات 26 ساعة من لترين من الماء المقطر لكل تغيير. بعد التغيير الأخير، إضافة 100 ميكرولترات من الحل الناتج إلى 400 ميكرولتردات من 4.5 ملليغرام لكل ملليلتر السل الأجسام المضادة السطحية، تليها إضافة 1-هيدروكسيبنزوتريزول و benzotriazol-1-yloxy ثلاثية التحللين فوسفونية هكساهوروفوسفات كمحفازات في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة مع التحريك.

فصل الحلول من الأجسام المضادة غير المنضمة من خلال الكروماتوغرافيا ترشيح هلام باستخدام برنامج تلفزيوني كمخزن مؤقت. لتحديد متوسط حجم الجسيمات ، مورفولوجيا ، وتوزيع الحجم ، إسقاط يلقي التشتت المركب على شبكة النحاس 200 شبكة والهواء الجاف العينة في درجة حرارة الغرفة قبل تحميلها على المجهر الإلكتروني انتقال للتصوير في 100 كيلوفولت. لقياس القيم الزمنية للاسترخاء من نانوروب، استخدم ريلاكستر بالرنين المغناطيسي النووي في 20 ميغاهيرتز و 37 درجة مئوية زائد أو ناقص درجة واحدة.

بالنسبة لتصوير الخلايا النابضة نانوبروفي، أولاً زراعة الإنسان THP-1 monocytes وفقاً لبروتوكولات ثقافة الخلية القياسية. عندما تكون الخلايا قد وصلت إلى المرحلة المناسبة من التنشيط، preincubate مرة واحدة 10 إلى 7 monocytes مع واحد مرات 10 إلى وحدات تشكيل مستعمرة السادسة من Mycobacterium bovis BCG لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، نقل الخلايا إلى أنابيب microcentuge ملليلتر واحد وإضافة ميليمولار من SPIO Mycobacterium السل السطحي مضادة الأجسام المترافقة نانوروبروب إلى كل أنبوب لاحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولترات من المتوسطة الطازجة. ثم، مسح العينات باستخدام تسلسل نبض صدى متدرج سريع من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي 3.0-T لتحديد خصوصية وحساسية البروتروبات النانوية. لتطعيم الحيوانات التجريبية باستخدام M.bovis BCG، قم أولاً بإعادة تشكيل اللقاح اللوائي أو المخزون البكتيري في وسط ساوتون وتمييع محلول المخزون المعاد تشكيله بالمحلول الملحي.

بعد ذلك ، قم بتحميل 100 ميكرولترات من المحلول في حقنة واحدة من المليلتر لكل وحقن الحجم الكامل للبكتيريا داخل الجسم في الجلد الظهري الأيسر أو الأيمن لكل فأر. في التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي للحيوانات الحية حقن نانوبروفي، الحصول على خط الأساس T2-المرجح صور صدى الدوران السريع من كل تجريبي مخدر قبل حقن اثنين نانوموللار من مسابير الأجسام المضادة لـ SPIO-TB المعلقة في 200 ميكرولترات من المالحة في الوريد الذيل لكل فأرة. ثم، صورة الحيوانات مرة أخرى مباشرة بعد الحقن وكل خمس دقائق لمدة 30 دقيقة القادمة.

في نهاية جلسة التصوير، تحليل كمي جميع الصور الرنين المغناطيسي باستخدام كثافة الإشارة كمقياس للمناطق المحددة من الاهتمام في مواقع مماثلة لمركز م. سل الحبيبية والعضلات الخلفية المجاورة لمنطقة الحبيبية. ثم استخدم الصيغة لحساب تحسينات الإشارة النسبية باستخدام قياس شدة الإشارة قبل ومن الصفر إلى ثلاث ساعات بعد حقن عوامل التباين. بعد شهر واحد من التطعيم ، وجمع الأنسجة من موقع التطعيم intradermal من كل وصمة عار من البارافين ثابتة الشكل جزءا لا يتجزأ من خمسة إلى 10 ميكرومتر عينات الأنسجة السميكة مع الهماوكسيلين وايوسين ، زيل - نيلسن البقع للبكتيريا الحمضية السريعة ، وبرلين الأزرق للحديد الحديديك.

يكشف التصوير المجهري للإلكترونات للإرسال لسطح SPIO-TB مضادة الأجسام النانوية أن البروتروبات النانوية تظهر مظهرًا مشتتًا جيدًا بمتوسط حجم 3.8 زائدًا أو ناقصًا 0.4 نانومتر لكل نواة. يمكن الكشف عن M.bovis BCG والإجهاد البكتيري سريع الحمضية من خلال تلطيخ زيهل-نيلسن. بعد العزلة والثقافة مع تحقيقات تحتوي على الحديد الحديديك، يمكن التعرف على البكتيريا من خلال تلطيخ أزرق برلين.

يمكن تحديد درجة استهداف السل للأجسام النانوية المضادة لسطح SPIO-TB من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح T2 كما هو مبين من خلال انخفاض في كثافة الإشارة في وجود البروتينات النانوية التي تحدث بطريقة تعتمد على التركيز. وفي الحيوانات التي تحقن بـ نانوبروب، يزيد تعزيز الإشارات المرجحة T2 في مناطق الحبيبات السلية بنحو 14 ضعفاً عن مستوى مواقع التحكم. بعد شهر واحد من العدوى ، يمكن ملاحظة ورم حبيبي تحت الجلد منظم في الفئران C57 السوداء التي حقنها نانوبروب مع الأوعية الدموية الجديدة في الدم وتراكمات الخلايا اللمفاوية والخلايا الظهارية التي لوحظت داخل هذه الآفات.

ويلاحظ أيضا تعبير السل إيجابية في المناطق الحبيبية مع عصيات حمض سريع تلطيخ إيجابية في موقع الآفة. كما يمكن استخدام اللون الأزرق في برلين، وهو وصمة إيجابية من حديد الحديديك، لتحديد حساسية المسابير للسل. في صورة الرنين المغناطيسي في الجسم الحي للحياة، تحصل الحيوانات التي حقنها نانوروب على صورة أساسية ذات وزن T2 سريع الدوران- صدى كل تجريبي مخدر قبل حقن مسابر الأجسام المضادة لـ SPIO-TB. والآن بعد أن أنشأنا تقنية SOP للكشف عن السل خارج الرئة، يمكن استخدام هذه الأجسام المضادة لتشخيص السل خارج الرئة على وجه التحديد.