أسلوب Fluorescence المستندة إلى دراسة تنظيم الجينات البكتيرية في الأنسجة المصابة

ويمكن لهذه الطريقة أن تكشف عن الأنماط المكانية للتعبير الجيني الجرثومي واستراتيجيات التكيف الفسيولوجي مع بيئات الأنسجة الصغيرة المضيفة التي تضيع عندما يتم متوسطها عبر السكان بأكملهم في الأنسجة. مع هذه التقنية يمكن الكشف عن التجانس المحتملة التي يجب النظر عند تحديد مسارات بكتيرية جديدة والبروتينات التي تستهدفها مضادة للفيروسات أو المركبات المضادة للبكتيريا. تبدأ من قبل streaking سلالات S.aureus من الفائدة على لوحات أجار الدم من مخزون الجلسرين المجمدة واحتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة لتأكيد أنماط ظاهرية انحلالية على أساس قدرتها على إزالة خلايا الدم الحمراء وتشكيل مناطق شفافة واضحة.

تلقيح مستعمرة واحدة يعزل كل سلالة في أربعة ملليلتر من مرق الصويا tryptic، أو TSB، في أنابيب زجاجية معقم وتدوير الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة في بكرة أنبوب في زاوية 70 درجة تقريبا و 70 التناوب في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر، أو OD 600، من الثقافات على مقياس الطيف وتمييع الخلايا إلى OD 600 من 0.05 في 25 ملليلتر من TSB العقيمة في خمسة إلى واحد نسبة قارورة إلى حجم في 125 ملليلتر ديلونج قارورة. احتضان الثقافات في حمام الماء 37 درجة مئوية في 280 التناوب في الدقيقة الواحدة والحصاد الخلايا خلال المرحلة الأسي.

بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الخلايا مرتين في حجم متساو من برنامج تلفزيوني عقيم. ثم إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني جديد إلى مرة واحدة 10 إلى مستعمرة الثامنة تشكيل وحدات لكل ملليلتر التركيز لحقنها اللاحقة في المتلقي. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، حصاد الكلى والقلب والكبد والرئتين والطحال في 15 ملليلتر أنابيب البولي بروبلين التي تحتوي على 10٪ buffered formalin ل 24 إلى 48 ساعة حضانة في الظلام في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف أو التناوب.

في نهاية التثبيت، تضمين الأعضاء في الأنسجة واضحة تجميد المتوسطة للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. استخدام الكوابيست للحصول على 10 ميكرومتر أقسام الأنسجة السميكة وتجفيف المقاطع على الفردية مسبقا تنظيف الشرائح الزجاجية المشحونة لمدة 20 دقيقة في الظلام قبل تطبيق الثابت تصاعد المتوسطة تكمل مع DAPI. ثم تطبيق زلات الغطاء وعلاج الشرائح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها قبل نقل العينات إلى التخزين على المدى الطويل في أربع درجات مئوية.

لتحديد الآفات داخل العينات، ضع شريحة على خشبة مسرح مجهر المجهر الدمجي بالليزر واستخدم هدفًا مناسبًا لتصور الخلايا الفردية للحصول على صور للآفات. لقياس شدة الفلوريسنس داخل الصور confocal، فتح صورة في ImageJ وضبط السطوع والتباين لتصور بشكل صحيح إشارة الفلوريسنس من الآفة. حدد المنطقة موضع الاهتمام باستخدام أداة تحديدات المضلعات وإضافة عائد الاستثمار إلى مدير عائد الاستثمار تحت علامة التبويب تحرير في ImageJ.

حدد تحرير، ثم تحديد، وأخيراً إضافة إلى المدير. بعد ذلك، أعد تسمية ROI وتسمية الصورة المعنية. لتعريف المركزية، افتح علامة التبويب تحليل وحدد ناحية، متوسط قيمة رمادية، متوسطة، وحد إلى حد.

استخراج قيمة كثافة الفلورس المركزية أو قياس شدة الفلورس في منطقة الوحدة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام دالة تحديد العتبة لتعيين حدود الفلورس السفلي والعلوي حسب الضرورة. قم بتصدير البيانات إلى ملف Excel واحضر عمودًا يشير إلى متوسط كثافة الفلورانس لكل منطقة وحدة للمحيط ولب.

لحساب متوسط شدة الفلور لكل وحدة في محيطها ولبها، حدد يدوياً الحدود العليا والدنيا للعتبة. المكورات العنقودية aureus ثيوراتسي الانصهار GFP الفلورسيه الانصهار في المتوسط ما يقرب من تسعة أضعاف أعلى في الخلايا التي تحمل جين الانصهار مما كانت عليه في الخلايا التي لا تحمل الانصهار مراسل. وبالمثل، جنبا إلى جنب dimeric الطماطم الانصهار fluorescence هو حوالي ستة أضعاف أعلى من سيطرة مراسل فارغة.

يمكن تأكيد نمط أنشطة المراسل عن طريق تدفق قياس خلايا الأنسجة المتجانسة. على الرغم من أن الاختلافات في طية fluorescence عادة ما تكون أقل. يمكن أن تكون الاختلافات في قياسات الفلوريسين نتيجة للتعبير غير المتجانس للمراسلين.

على سبيل المثال، في هذه العينات التمثيلية لوحظ أن بعض الآفات تعبر عن أحد أو كليهما من المراسلين في حدود 100 ميكرومتر تقريباً من المسافة في نفس عينة الأنسجة. فحص نشاط المراسل إلى قرار خلية واحدة في المجتمعات abcess المكورات العنقودية يكشف عن تنظيم مكاني من التعبير الحراري المكوراتية في خراجات محيطة بتلوين DAPI قوي ، من المرجح أن يرتبط بتشكيل وإطلاق الفخاخ خارج الخلية العدلات. على سبيل المثال، لوحظ فلورسي الانصهار في الانصهار في المكورات العنقودية Aureus aureus ثيوفر في القلب الداخلي للمجتمع abcess المكورات العنقودية مقارنة بـ localized إلى المحيط المحيط.

في نفس abcess، نمط الفلوري الانصهار الطماطم الترادف يبدو أن مقلوب. ومع ذلك، لم يكن النمط في هذه التجربة ذا دلالة إحصائية. الحصول على تشريح التبريد المضمنة سليمة أمر حيوي لتحليل صورة الفلوريسنس وينبغي القيام به بعناية.

فرز الخلايا البكتيرية لالتقاط مجموعات فرعية تعبر عن الانصهار بدرجات متفاوتة ، إلى جانب تحليل الحمض النووي الريبي - Seq يمكن أن يضيء التغيرات الجينومية الواسعة في النص. رعاية عند العمل مع formalin كما هو مسرطنة، ويمكن أن يسبب تهيج الجلد, الحساسية, أو تلف العين عند التعرض المباشر. ويمكن أن يساعد توليد مشتقات متحولة من السلالات التي تحمل مراسلي الفلورسنت موضع الاهتمام في الكشف عن الأساس الوراثي للأنماط التنظيمية المكانية الملحوظة.