مقايسة الفائق "التنبؤ بالسمية الكيميائية" "الآلي التنميط المظهرية" من ايليجانس كاينورهابديتيس
مارس 14, 2019
وقد وضعت أسلوب كمي لتحديد وتوقع السمية الحادة للمواد الكيميائية من خلال تحليل تلقائياً تحديد سمات المظهرية ايليجانس كاينورهابديتيس. ويصف هذا البروتوكول كيفية علاج الديدان مع المواد الكيميائية في صفيحة 384-جيدا، والتقاط الفيديو، والتحديد الكمي للسمية ذات الصلة تعمل.
C.elegans السمية المقايسة قيمة. يصف هذا البروتوكول كيفية علاج C.elegans بالمواد الكيميائية في لوحة 384 بئرًا ، والتقاط مقاطع الفيديو ، وقياس الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالسمية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد السمية الحادة المحتملة للمواد الكيميائية والتنبؤ بها.
وقد تم تطوير هذه التقنية الكمية لتحليل تلقائيا المعلمات 33 من C.elegans بعد 12 إلى 24 ساعة من العلاج الكيميائي في لوحة 384-well مع المتوسطة السائلة. C.elegans قيمة كنموذج جيد للتقييم السريع للسمية للمواد الكيميائية الجديدة. كما الفئران، ويمكن تطبيقه على فحص السمية واختبار المواد الكيميائية الجديدة، أو المركب كما التلوث عامل المضافة الغذائية، مركب الصيدلانية، البيئة المركب الخارجي، وهلم جرا.
قراءة البروتوكول بعناية واتبع دائما مع خطوة بخطوة، ثم سوف تكون واحدة جيدة. العرض التوضيحي المرئي أسهل للمستخدم لمشاهدة عملية كل خطوة، و نتيجة العملية. وسوف يكون من بين الاجراءات ون جينغ تشانغ وقاوتشاو هان .
إنهم طلاب دراسات عليا من مختبري. للبدء، إجراء اختبار فتاك دودة أولية لمايائية جديدة، لتحديد أعلى جرعة، وأقل جرعة، والتي هي الحد الأدنى للتركيز من 100٪ فتاك، والحد الأقصى للتركيز من 100٪ غير فتك. لهذه التجربة، إعداد سبعة تركيزات متدرجة من كلوريد الكادميوم.
لإعداد مرتين أعلى محلول مائي مركز ، قم بحل 92.8 ملليغرام من مسحوق كلوريد الكادميوم الصلب في أنبوب طرد مركزي مملوء بثمانية ملليلترات من K المتوسطة. دوامة لخلط. بعد أن يذوب المسحوق بالكامل ، استخدم ماصة لملء ما يصل إلى 10 ملليلتر.
إعداد مستويات التركيز الأخرى عن طريق التخفيف مع K المتوسطة. في مقعد فائقة نظيفة، واستخدام طرف عقيمة لاختيار مستعمرة واحدة من OP50 E.coli من لوحة خط، ووضعها في قارورة مع 100 ملليلتر من مرق LB لتطعيم المستعمرة. تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شاكر الحاضنة.
صب NGM في 90 ملليلتر لوحة بيتري البلاستيك. بذور كل لوحة مع 300 ميكرولترات من محلول E.coli OP50. تحتضن ديدان N2 على لوحات NGM مع OP50 عند 20 درجة مئوية لحوالي 2 إلى 3 أيام، حتى وصلت معظم الديدان إلى مرحلة البلوغ.
مع الماء العقيم، وغسل أسفل الديدان جرافيد في أنبوب مخروطي معقم 15 ملليلتر لحصاد. دع الديدان تستقر لمدة دقيقتين على الأقل. استلهم الماء وأضيف خمسة ملليلترات من عازلة التبييض.
دوامة الأنبوب لمدة خمس دقائق، ومن ثم وضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي لتدور في قوة طرد مركزي النسبية من 1300 لمدة 30 ثانية لبيد البيض. استخدام ماصة لpirate ابراء. إضافة خمسة ملليلتر من المياه المعقمة في أنبوب لغسل البيض، ودوامة الأنبوب لمدة خمس ثوان.
جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 30 ثانية، في قوة طرد مركزي النسبية من 1300. إزالة ناظرة وإضافة خمسة ملليلتر من المياه المعقمة لغسل مرة أخرى. مازيت البيض على لوحة NGM جديدة مع OP50.
احتضانهم في 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، الديدان المفقوسة تصل إلى مرحلة L1. بعد حوالي 40 ساعة، تصل الديدان إلى مرحلة L4.
مع K المتوسطة، وغسل الديدان المرحلة L4 قبالة لوحات بيتري في أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر. ماصة 50 ميكرولترات من السائل دودة من أنبوب إلى شريحة زجاجية. تحت مجهر ستيريو، واستخدام ماصة لضبط تركيز الديدان إلى ما يقرب من 40 الحيوانات لكل 100 ميكرولترات من K المتوسطة.
إضافة 50 ميكرولترات من المتوسط المعدة في كل بئر من لوحة 384-well. هذه متزامنة L4 مرحلة الديدان جاهزة للمعالجة التالية بواسطة المواد الكيميائية. قبل إضافة المواد الكيميائية، ضع لوحة 384-well، مع الديدان المتزامنة على المسرح التلقائي، وإعداد كاميرا فيديو مع إجراء الاستحواذ المبرمج.
في لوحة 384-جيدا، يتم التعامل مع الديدان مع ست إلى سبع جرعات من كل مادة كيميائية على حدة، مع ثمانية آبار موازية تحتوي على 50 ميكرولترات من محلول كيميائي مرتين لكل جرعة. إعداد ما لا يقل عن ثلاث مجموعات من ثمانية آبار موازية من K المتوسطة كتحكم. إضافة 50 ميكرولترات من محلول الكيميائية مرتين لكل بئر.
تعيين الوقت كنقطة ساعة الصفر. ثم، وضع لوحة 384 جيدا في حاضنة شاكر تعيين في 20 درجة مئوية، و 80 الثورات في الدقيقة الواحدة. بعد الوقت المطلوب، وإزالة لوحة من الحاضنة، ونقلها إلى المرحلة التلقائية.
خذ مقاطع فيديو لكل بئر من الصحن، في الساعة 12، وفي الساعة 24 للتحقق من الأنماط الظاهرية للدودة. لبدء معالجة الفيديو التجريبي، قم بنقل ملفات الفيديو إلى الكمبيوتر. عبر واجهة المستخدم الرسومية ، انقر على زر تحديد ، لاختيار دليل الصور المصدر.
إضافة دليل النتائج الوسطى. وتشمل النتائج الوسطى الصور المجزأة، التي تعتبر مفيدة للمراقبة البصرية للصور المعالجة. إضافة الدليل النتيجة النهائية في الواجهة.
تعيين متوسط المعلمة حجم الفيروس المتنقل في 2, 000, في مربع النص حجم الفيروس المتنقل في الواجهة. تعيين عتبة نسبة نقل في 0.93 في الواجهة. انقر على الزر تحليل لبدء معالجة الصورة.
يمكن للبرنامج المطور التعرف على الديدان وقياس الأنماط الظاهرية تلقائيًا. في هذه التجربة، تم تحديد 33 ملامح مميزة لمعالجة كلوريد الكادميوم في ثلاث نقاط زمنية، صفر ساعة، 12 ساعة، و 24 ساعة. وتظهر الصور التجريبية أن الديدان ماتت بسرعة أكبر مع زيادة التركيز الكيميائي.
في البداية ، لم يكن هناك فرق كبير بين التحكم والعلاجات الكيميائية. بعد 12 ساعة من العلاج، أصبحت الديدان المعالجة بتركيزات عالية أكثر استقامة وأقل منحنيًا من التركيزات الأقل أو في مجموعات التحكم. زاد طول المحور الرئيسي للجسم الدودة المنطقة المغطاة مع زيادة الوقت.
وهناك أيضاً اتجاه متدرج من التركيزات الكيميائية المنخفضة إلى التركيزات الأعلى في كل من المحور الرئيسي وفي طول المحور الثانوي. وأظهرت حركة الديدان، استنادا إلى المنطقة والنسبة، أنماطا مماثلة. ولم يلاحظ أي فرق كبير في البداية.
مع مرور الوقت، أظهرت الديدان في مجموعة التحكم انخفاضًا مستقرًا في الحركة. وبعد 12 و24 ساعة، أظهرت الديدان التي تم علاجها بكلورايد الكادميوم اختلافات كبيرة في الحركة، مقارنة بمجموعات التحكم. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الديدان تحت علاجات التركيز العالي حركة أضعف، مقارنة بالدود تحت معالجات التركيز المنخفضة.
وباختصار، تمهد هذه التقنية طريقة لتقييم السمية السريع في مناطق متعددة. الباحثون التي يمكن تطبيق هذه الطريقة على تحليل الطوارئ للسمية في سمية تحملها الأغذية، وتقييم سلامة المركبات الصيدلانية، فضلا عن فحص السمية الحادة، والكشف عن المواد الكيميائية الجديدة، والمركبات الخارجية البيئية. كلوريد الكادميوم هو مادة منخفضة السمية.
يرجى ارتداء القفازات وقناع أثناء التعامل مع الخاص بك، واتبع تعليمات التشغيل.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة كمية لتقييم السمية الحادة للمواد الكيميائية باستخدام Caenorhabditis elegans. من خلال علاج الديدان في لوحة 384 بئرًا وتحليل استجاباتها المظهرية، يمكن للباحثين التنبؤ بالتأثيرات السامة المحتملة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم السموم
- علم الأعصاب
- الاختبارات البيولوجية
الخلفية
- يعمل C.elegans كنموذج فعال للكائن الحي لتقييم السمية.
- تتيح الطريقة الفحص السريع للمواد الكيميائية الجديدة.
- يمكن تطبيقها على مركبات مختلفة، بما في ذلك المواد المضافة إلى الأغذية والمستحضرات الصيدلانية.
- يمكن أن تكشف النمذجة المظهرية رؤى حول التأثيرات السمية.
غرض الدراسة
- تطوير بروتوكول موحد لاختبار السمية باستخدام C.elegans.
- أتمتة تحليل البيانات المظهرية لزيادة الكفاءة.
- تعزيز التنبؤ بالسمية الحادة في المواد الكيميائية.
الطرق المستخدمة
- تعرض C.elegans للمواد الكيميائية في صيغة لوحة 384 بئرًا.
- التقاط الفيديو لسلوك الدود بعد العلاج.
- تحديد كمي لـ 33 شكلًا مظهريًا مرتبطًا بالسمية.
- يتم التحليل بعد 12 إلى 24 ساعة من التعرض.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في تحديد التأثيرات السامة بناءً على التغيرات المظهرية.
- يحسن التحليل الآلي سرعة ودقة تقييمات السمية.
- يمكن أن تفيد النتائج في تقييم سلامة المواد الكيميائية الجديدة.
- يثبت C.elegans كونه نموذجًا موثوقًا لفحص السمية السريع.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول إطارًا متينًا لتقييم سمية المواد الكيميائية.
- يعزز التحليل المظهري الآلي قدرات البحث.
- تدعم النتائج استخدام C.elegans في البحث السمي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This high-throughput phenotypic profiling assay enables rapid, automated prediction of chemical acute toxicity using C. elegans, reducing reliance on rodent models for early-stage screening. By quantifying 33 worm features after chemical exposure, the method supports data-driven prioritization of compounds for further toxicological evaluation, improving efficiency in lead identification and safety assessment workflows. The approach aligns with industry needs for predictive, mechanistically informed de-risking in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of toxicological mechanisms through quantitative phenotypic profiling of chemical exposure effects.
- Operational Value: Supports hypothesis testing via automated, reproducible readouts of worm motility, morphology, and behavior.
- Predictive Value: Facilitates early de-risking by identifying compounds with acute toxicity potential before investing in traditional rodent studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative phenotypic data from 384-well plate formats for consistent compound evaluation.
- Operational Value: Enables high-throughput screening with automated video capture and image analysis, reducing manual intervention.
- Assay Readiness: Produces scalable, multiplexed outputs that support hit-to-lead progression and cross-project reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery toxicity screening with preclinical rodent testing by establishing a priority list for follow-up assessment.
- Mechanistic De-risking: Links phenotypic changes (e.g., motility, body axis) to toxicological outcomes, supporting biomarker-aligned decision-making.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by predicting acute liability early in the discovery pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum, positioning phenotypic profiling after compound synthesis and before lead optimization, where predictive toxicity data informs prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven toxicity assessment by quantifying biological responses to chemical perturbation in a whole-organism context.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible outputs from 384-well formats, enabling parallel testing of multiple concentrations and compounds.
- Analytics: Provides 33 quantified phenotypic features (e.g., motility, curvature, axis length) that serve as multidimensional readouts for structure-activity relationship modeling.
- Translational Research: Connects early phenotypic signatures to apical toxicity endpoints, guiding resource allocation for rodent-based validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, automatable platform applicable across therapeutic areas and chemical classes (e.g., pharmaceuticals, food additives, environmental compounds).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in toxicity profiling through mechanistically relevant, whole-organism phenotypic readouts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput via automated liquid handling, video capture, and image analysis in 384-well plates.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by enabling early identification of toxic liabilities, improving capital efficiency in preclinical development.
- Portfolio Impact: Supports risk-based prioritization, allowing teams to deprioritize high-risk compounds and focus resources on safer candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, synchronization, and phenotypic assay design.
- Depends on automated microscopy, temperature-controlled incubation, and video acquisition systems compatible with 384-well plates.
- Necessitates standardized protocols for worm preparation, chemical dispensing, and control group inclusion to ensure data comparability.
- Involves optimization of image analysis parameters (e.g., worm size threshold, movement ratio) for accurate feature extraction across compound classes.
- Limited to phenotypes detectable in C. elegans; may not capture organ-specific toxicities relevant to human physiology without orthogonal validation.
