إعداد الفطريات والمواد النباتية لتوضيح الهيكلية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي الصلبة دينامية الاستقطاب النووي

يمكن استخدام هذا البروتوكول لإعداد المواد الفطرية والمصنعة للرنين المغناطيسي النووي الصلب، أو NMR، والاستقطاب النووي الديناميكي، أو DNP، لتجارب توصيف النظام الحيوي المعقد. هذه التقنية تسمح لنا بالتحري عن المواد الحيوية إلى مستوى الدقة الذرية في بيئتها الأصلية، على سبيل المثال، في الخلايا الكاملة. ومن شأنه أن يساعد الحصول على معلومات هيكلية عالية الاستبانة عن المواد الفطرية في تطوير العقاقير المضادة للفطريات.

توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في تكوين وهيكل الكربوهيدرات المعقدة في جدران الخلايا الفطرية ويمكن تطبيقها على العديد من الكائنات الغنية بالكربوهيدرات ، بما في ذلك النباتات والفطريات والطحالب والبكتيريا. قد يعاني بعض المحققين من التلوث الفطري في ثقافاتهم الخلوية. نصيحتي هي تعقيم المتوسطة والمعدات بدقة قبل استخدامها لمنع هذا التلوث.

هذا العرض سوف يساعد المحققين ذوي الخبرة القليل في مجال NMR أو ثقافة الخلية على تعلم كيفية تنفيذ هذه التقنيات في النظم الفطرية والنباتية. لإعداد متوسط نمو سائل غير موسوم، حل 6.5 غراما من الخميرة استخراج الببتون ديكستروز أو مسحوق YPD في 100 ملليلتر من الماء المقطر، ثم أتمتة الحل الناتج لمدة 25 دقيقة في 134 درجة مئوية. لإعداد متوسط النمو الصلبة غير المُسمية، أضف 6.5 جرام من مسحوق YPD agar إلى 100 ملليلتر من الماء المقطر، وأتلاف المتوسط لمدة 25 دقيقة عند 121 درجة مئوية، قبل تبريد المتوسطة إلى حوالي 50 درجة مئوية.

ثم، نقل 13 إلى 15 ملليلتر من المتوسطة نمو الصلبة الذائبة في أطباق بيتري البلاستيكية العقيمة الفردية، وعلى الفور وضع الأغطية على الأطباق. لإعداد الكربون-13، النيتروجين-15 المسمى وسيط نمو السائل، وضبط حجم 100 ملليلتر من النظائر التي تحتوي على الحد الأدنى المتوسطة إلى درجة الحموضة من 6.6 مع حمض أو قاعدة حسب الضرورة. بعد ذلك، قم بحل الأملاح المدرجة في الجدول في 100 ملليلتر من الماء المقطر، وإضافة إلى الكربون-13، النيتروجين-15 المسمى متوسطة النمو السائل، وأتمتة الحل الناتج لمدة 25 دقيقة في 121 درجة مئوية.

عندما يكون الحل قد بردت إلى درجة حرارة الغرفة، إضافة 100 ميكرولترات من العناصر النزرة حل لكامل حجم الكربون-13، النيتروجين-15-المسمى الحد الأدنى المتوسطة. لزراعة المواد الفطرية، استخدم حلقة تلقيح لنقل كمية صغيرة من الفطريات من التخزين على لوحة YPD، وثقافة الفطريات لمدة يومين في حاضنة 30 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، استخدم حلقة تلقيح جديدة لنقل حافة فطرية نشطة متنامية إلى غاز الكربون-13، ووسيط النمو السائل المسمى بالنيتروجين-15، ووضع الثقافة عند 30 درجة مئوية و220 دوران في الدقيقة لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام في حاضنة تهتز.

عندما تغطي كميات كبيرة من الفطريات قاع القارورة وتطفو في السائل ، اجمع الفطريات عن طريق الطرد المركزي والتخلص من الماذرة. هيدرات بيليه مع الحل المناسب، واستخدام ملقط لجمع حوالي 0.5 غرام من بيليه رطب جيدا لتحليلات NMR وDNP. ثم، مزيج المواد المتبقية مع محلول 20٪ الجلسرين في أنبوب مخروطي، ووضع عينة الفطرية في ناقص 80 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل.

لإعداد A.fumigatus لتحليل NMR الصلبة الحالة، استخدم أولا كيس غسيل الكلى مع قطع الوزن الجزيئي 3.5 كيلودالتون لsumze الكربون 0.5 غرام-13، النيتروجين-15 المسمى عينة فطرية مقابل لتر واحد من 10 ملليمولار العازلة الفوسفات في أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أيام لإزالة الجزيئات الصغيرة من وسط النمو. في نهاية غسيل الكلى، نقل العينة إلى أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي، وحزمة 70 إلى 80 ملليغرام من عجينة عينة ذات علامات الكربون 13 وهيدرات بشكل جيد في دوار ثاني أكسيد الزركونيوم من أربعة ملليمترات. استخدم قضيبًا معدنيًا للضغط على العينة برفق وبشكل متكرر، باستخدام الورق لامتصاص المياه الزائدة.

ثم، بإحكام غطاء الدوار، وإدراج العينة في مطياف لتوصيف NMR الحالة الصلبة. لإعداد A.fumigatus لتحليل DNP ، إضافة 100 ميكرولترات من مصفوفة DNP في أنبوب ميكروسنتروجي واحد 1.5 ملليلتر لكل الكربون -13 ، عينة فطرية تحمل علامة كربون 15 ، واذاب 0.7 ملليغرام من عامل الاستقطاب لكل أنبوب لتشكيل محلول مخزون جذري 10 ملليمولار. بعد دوامة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لضمان أن الجذور هي حل كامل في الحل، نقع 10 ملليغرام من الكربون-13 dialyzed، النيتروجين-15 المسمى عينة فطرية في 50 ميكرولترات من حل عامل الاستقطاب، واستخدام آفة وقذائف هاون لطحن معتدل الخليط لضمان اختراق الجذور في جدران الخلايا المسامية.

إضافة 30 ميكرولترات أخرى من الحل الجذري إلى بيليه الأرض لمزيد من هيدرات العينة الفطرية، وحزمة بيليه في دوار الياقوت 3.2 ملليمتر. الضغط بشكل معتدل وإزالة المذيبات DNP الزائدة كما هو موضح، وإضافة سد سيليكون 3.2 ملليمتر لمنع فقدان الترطيب. ثم يضاف الدوار إلى مطياف NMR للتجربة الروتينية أو مطياف DNP لقياس الطيف المعزز من DNP تحت إشعاع الميكروويف.

لإعداد المواد النباتية لدراسات DNP، استخدم شفرة حلاقة لقطع المواد النباتية ذات العلامات الكربونية الموحدة 13 إلى قطع من ملليمتر إلى ملليمترين. استخدام هاون وحشرات لطحن القطع إلى جزيئات أصغر حتى مسحوق النهائي له مظهر متجانس. إضافة 40 ميكرولترات من 10 ميل الجذر الأسهم ميليمولار إلى المواد النباتية، وطحن طفيفة العينة لمدة خمس دقائق إضافية لضمان الاختلاط متجانسة مع الراديكالية.

هيدرات العينة الأرض مع آخر 20 ميكرولترات من محلول الأسهم الراديكالية، وحزم عينة النباتات التوازنية في دوار الياقوت 3.2 ملليمتر لتحليل DNP. ثم أدخل قابس سيليكون لتجنب فقدان الترطيب، وقم بتحميل العينة على مقياس الطيف DNP. إن وضع العلامات النظيرية يعزز بشكل كبير حساسية NMR ويجعل من الممكن قياس سلسلة من الكربون ثنائي الأبعاد-13-carbon-13 و 13-13-نيتروجين-15 أطياف الارتباط لتحليل تكوين، ترطيب، التنقل، وتعبئة البوليمرات لدمجها لبناء نموذج ثلاثي الأبعاد من بنية جدار الخلية.

وإذا كان من الصعب الحصول على إشارات غير قطرية في طيف الكربون ثنائي الأبعاد من 13-13، فقد يكون وضع العلامات الإحصائية قد حدث. وتعتبر الذروتان الكربونيتان-13 في 96 و92 جزءا في المليون إشارات الكربون-1 المميزة للجلوكوز. ولذلك، فإن كثافاتها القوية في أطياف الاستقطاب المباشر للكربون-13 الكمية التي تقاس بتأخيرات إعادة التدوير الطويلة لمدة 35 ثانية تشير عادة إلى هيمنة الجزيئات الصغيرة بسبب غسيل الكلى أو الغسيل غير الكامل.

مع عينات تحمل علامات جيدة، يمكن قياس الارتباطات طويلة المدى للكشف عن القرب المكاني للجزيئات الحيوية وبناء نموذج هيكلي لجدران الخلايا السليمة. هذه التقنية تسمح وظيفة هيكل في العديد من المواد الطبيعية التي تحدث وهندستها لاستكشاف، وتسهيل الدراسات المستقبلية للمواد الحيوية الغنية بالكربوهيدرات والبوليمرات وظيفية. كما قد تسبب بعض الفطريات العدوى أو الأمراض المنهجية في البشر، تأكد من التعامل مع المواد الفطرية في غطاء محرك تدفق ملكي للحماية ولتقليل التعرض.