Overexpressing الكشف فضله منذ فترة طويلة باستخدام الجينات-تفعيل كريسبر
March 1st, 2019
التقنيات التقليدية المستندة إلى كدنا overexpression انطباقاً محدودا overexpression الكشف فضله منذ فترة طويلة بسبب أشكالها لصق متعددة مع الوظائف المحتملة. هذا الاستعراض تقارير بروتوكول باستخدام تكنولوجيا كريسبر إلى أوفيريكسبريس متعددة المتغيرات لصق الحمض النووي الريبي فضله منذ وقت طويل.
RNAs غير متكد غالبا ما يكون isoforms متعددة. في دراسات فرط التعبير في المختبر ، غالبا ما يكون من الصعب دراسة كل هذه isoforms أعرب. هذه التقنية تسمح للمستخدمين لاشتقاق التعبير مباشرة من الجينوم وتمكين الخلايا للتعبير عن isoforms الذاتية لرنا غير متكود معين.
هذه التقنية القوية تسمح للمستخدم بتوجيه التعبير عن أي جين في الجينوم بدقة ودقة. من خلال تصميم RNAs دليل لجينات محددة، واحد هو قادر على استخدام آلة الربط الجينية الذاتية للتعبير عن isoforms الطبيعية في خلية معينة. إثبات الإجراء سيكون روبرت رانكين، طبيب ما بعد الطبيب من مختبري.
لتصميم تسلسل RNA الدليل الذي يقع ضمن أزواج قاعدة 100 من موقع بدء النسخ، واستخدام قواعد البيانات الجينية مثل BLAT للتأكد من أن RNA دليل فريدة من نوعها لجين من الفائدة. تخزين الجيش الملكي النيبالي الدليل وتعطيلها Cas9 plasmids في أربع درجات مئوية. خط خارج E.coli على لوحة مرق لوريا أجار مع الأمبيسيلين وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، اختر مستعمرة وتنمو البكتيريا في خمسة ملليلتر من LB مع الأمبيسيلين بين عشية وضحاها ، وهز بقوة الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، إضافة مليلترين من البكتيريا إلى 200 ملليلتر من LB مع الأمبيسيلين في قارورة سعة لترين، يهز بقوة القارورة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية. تدور أسفل البكتيريا في 3، 724 مرات ز لمدة 20 دقيقة والمضي قدما في تنقية الحمض النووي.
لإنشاء فيروس العدس dCas9 التي تحتوي على, معطف أول 100 ملليلتر الأنسجة الأطباق ثقافة مع خمسة ملليلتر من 0.01٪ بولي-L-ليسين ولوحة خمسة ملايين HEK293T الخلايا في طبق في 10 ملليلتر كاملة من النسور المعدلة كاملة من النسور المتوسطة, ثم إعداد عينات نقل الحمض النووي عن طريق خلط 10 ميكروغرام من ناقل RNA دليل يحتوي على LTR أو ناقل Cas9 المعطلة التي تحتوي على LTR مع plasmids تحتوي على مكونات الفيروسات. يضاف الماء إلى حجم إجمالي قدره 450 ميكرولترات وتصفية الخليط من خلال طرف مرشح 0.2 ميكرون تعلق على حقنة. بعد ذلك، أضف 50 ميكرولترات من 2.5-2-المولر كلوريد الكالسيوم لكل عينة من الحمض النووي ومزيج بلطف.
قم بتصفية خليط الكالسيوم والحمض النووي من خلال طرف مرشح 0.2 ميكرون متصل بحقنة. Pipette 500 ميكرولترات من 2X HBS في أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر. إضافة 500 ميكرولترات من الكالسيوم والحمض النووي خليط قطرة ودوامة بلطف.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. إضافة ملليلتر واحد من تعليق الحمض النووي والكالسيوم HBS لكل طبق ثقافة الأنسجة المحتوية على HEK293T واحتضانها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم الثالث، قم بإزالة وسائل الإعلام ببطء وتجاهلها من الأطباق.
غسل الخلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إضافة ستة ملليلتر من DMEM كاملة تكملها HEPES 20 ملليمولار و 10 ملليمولار بتيرات الصوديوم. ثم احتضان الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى ست ساعات.
بعد الحضانة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة وإضافة خمسة ملليلتر من DMEM كاملة مع HEPES 20 ملليمولار إلى خلايا HEK293T. احتضان الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. في اليوم الرابع، جمع عظمى خلية HEK293T وتصفية عظمى تحتوي على الفيروس.
للبدء في عدد الجسيمات الفيروسية، قم أولاً بتخفيف تركيز الغسيل من مجموعة P24 ELISA عن طريق إضافة 19 جزءًا من الماء المقطر والمأين. ثم، تمييع السيطرة الإيجابية من هذه المجموعة إلى 200 نانوغرام لكل ملليلتر باستخدام 1640 1640 1640 كما diluent وجعل التخفيفات لمنحنى القياسية في أنابيب 1.5 ملليلتر وفقا لجدول تخفيف P24 ELISA. لقياس تركيز الفيروس داخل العينات إضافة التخفيف العينة إلى الآبار المعينة من لوحة 96-جيدا، بدءا من تخفيف 1:1000 وتعديل حجم حسب الضرورة من أجل أن تكون ضمن نطاق المنحنى القياسي.
ثم تمييع العينات مع تريتون X-100 إلى تركيز نهائي من 0.5٪وإضافة 200 ميكرولترات من كل عينة و RPMI 1640 إلى الآبار المعينة. ختم لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. اغسل الطبق بـ 300 ميكرولترات لكل بئر من عازل الغسيل 1X ست مرات.
إزالة أي السوائل الزائدة عن طريق عكس لوحة والاستفادة منه على منشفة ورقية. ثم إضافة 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة للكشف من عدة إلى جميع الآبار باستثناء الركازة فارغة. ختم لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
اغسل الطبق ثم ازيل أي سائل زائد عن طريق عكس اللوحة والنقر عليها على منشفة ورقية. من أجل قياس الأجسام المضادة للكشف، وتمييع بيروكسيديز الفجل streptavidin في 1:100 تخفيف مع SA-HRP اللوين. اخلطي SA-HRP المخففة بدقة وأضيفي 100 ميكرولترات إلى جميع الآبار باستثناء الفارغ.
ختم واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الطبق مع المخزن المؤقت 1X والاستفادة من أي سائل زائد. إسقاط واحد تقويم العظام-phenylenediamine قرص في 11 ملليلتر من الزاوي الركيزة لجعل ما يكفي من محلول الركيزة لصفيحة واحدة.
دوامة الحل OPD بقوة لإذابته تماما وحمايته من الضوء. إضافة 100 ميكرولترات من محلول الركيزة OPD لجميع الآبار بما في ذلك فارغة. باستخدام مقياس الطيف، قراءة امتصاص في 450 نانومتر على الفور.
كرر 10 مرات على فترات ثانية واحدة واتخاذ متوسط القياس. Resuspend والثقافة Jurkat الخلايا التائية في قارورة T75 مع كثافة من مليون خلية في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام المصل انخفاض مع البوليبرين. ثم أضف HEK293T وسائل الإعلام المكيفة التي تحتوي على مليون من الجسيمات الفيروسية المحتوية على dCas9.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثلاثة أيام بعد العدوى, تدور أسفل الخلايا في 233 الوقت ز لمدة خمس دقائق و resuspend لهم في 10 ملليلتر من DMEM كاملة تكملها مع البورومايسين. ثقافة الخلايا في T75 قارورة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
كل يوم ثالث لمدة تسعة أيام، تدور أسفل الخلايا في 233 مرات ز لمدة خمس دقائق واستبدال وسائل الإعلام مع DMEM كاملة تكملها البوريميسين. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي. ثم، على لوحة 96-well مع الأنسجة المعالجة ثقافة الأنسجة، إضافة 10،000 الخلايا في 100 ميكرولترات من DMEM كاملة تستكمل مع البورومايسين في البئر الأولى.
جعل 1:1 تخفيف المسلسل من محتويات الآبار التالية مع DMEM كاملة تكمل مع البوروميسين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. توسيع الخلايا المنعزلة إلى اثنين من لوحات 24 جيدا، ثم لوحة مليوني خلية في بئر من لوحة ستة جيدا لثلاثة من المستنسخين.
لوحة الآبار الثلاثة الأخرى مع خلايا جوركات غير مستحثة كضوابط. وأخيرا، لوحة الخلايا في قارورة T75 ووضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. لبدء PCR الكمي لقياس التعبير الجيني، أولا توليف الحمض النووي التكميلي عن طريق إضافة ميكروغرام واحد من الجيش الملكي النيبالي، وأربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت التوليفية cDNA، وميكر واحد من النسخ العكسي إلى 250 أنابيب ميكرولتر، ثم إضافة الماء إلى حجم النهائي من 20 ميكرولتر.
ثم، استخدام دورة حرارية في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإلغاء تنشيط النسخ العكسي. تمييع cDNA مع 60 ميكرولترات من الماء بعد التوليف. تشغيل تفاعل البوليميراز سلسلة من الأنابيب التي تحتوي على 0.5 ميكرولترات من كل إلى الأمام وعكس التمهيدي في التركيز النهائي من 10 ميكرومولار، وخمسة ميكرولترات من الأخضر SYBR، وأربعة ميكرولترات من cDNA.
وأخيراً حدد Jurkat-dCas9 الخلايا في DMEM تكمل مع هيغروميسين B لمدة 10 أيام. تدور أسفل الخلايا وتغيير وسائل الإعلام كل ثلاثة أيام. تنقية RNAse والمضي قدما إلى RT-qPCR.
في هذه الدراسة، تم استخدام تسلسلات GRNA التي كانت ضمن 10 إلى 100 زوج قاعدة بعيدًا عن موقع البدء النسخي لتوجيه مجمع Cas9-activating إلى مكان النسخ من IFNG-AS1، وهو رنا طويل غير متكد مرتبط بمرض الأمعاء الالتهابي. لتمكين اختيار الخلايا المستحثة المزدوجة ، تم استخدام نظام ثنائي البلازميد لتحويل إما dCas9 أو gRNAse محسنات إلى خلايا. هنا بروتينات MS2 تعزيز التعبير الزائد من IFNG-AS1.
تم تأكيد تعبير Cas9 لكل من المستنسخين. استخدمت ال التمهيديات ضد HPRT1 لتأكيد وجود الحمض النووي الريبي في الخلايا غير المستحثة. تم تأكيد التعبير مرنا عن طريق حذف نسخة عكسية من رد فعل cDNA.
ويمكن الكشف عن ثلاثة متغيرات لصق من IFNG-AS1 مع مجموعات التمهيدي نسخة محددة أو التمهيدي تعيين ضد جميع النصوص IFNG-AS1 المعروفة. وكانت جميع منحنيات الفلوريسنس أسية مع الجينات التدبير المنزلي HPRT1 الوصول إلى المرحلة الأسية في غضون دورة نصف بين التحكم والخلايا IFNG-AS1 رنا التعبير عن. كانت ال التمهيديات ضد جميع النسخ القياسية المعروفة IFNG-AS1 هي الأكثر قابلية للكشف بين التجارب، مع قياسات الزيادات 20 أضعاف في التعبير IFNG-AS1.
غير أن النص الثالث من النظام IFNG-AS1 أظهر زيادة كبيرة من خمسة إلى عشرة أضعاف في مستويات IFNG-AS1. لفرط بنشاط الجين الخاص بك المطلوب ، وتصميم RNA دليل في الخطوة 2.1 أمر بالغ الأهمية لنجاح البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، فإن إنتاج الجسيمات الفيروسية عالية الجودة سيضمن التعبير القوي عن مكونات البروتوكول الخاصة بك.
بمجرد أن يتم التعبير عن الجين المطلوب بشكل مفرط ، يمكن إجراء دراسات وظيفية للتحقيق في آليات الجينات. في مثالنا، اخترنا أن ننظر في إنتاج السيتوكين بعد فرط التعبير عن جيناتنا ذات الاهتمام. وقد تم تطوير هذه التقنية في البداية من قبل مجموعة غريسباخ في عام 2013 وتم تطبيقها على نطاق واسع وتفصيلها من قبل مجموعات أخرى.
كنا متحمسين لتطبيق هذه التقنية على RNAs طويلة غير مشفرة من أجل استكشاف وظائفها المحددة. يجب التعامل مع فيروسات العدسية المعيبة في المختبر الذي تمت الموافقة عليه للعمل الفيروسي. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر خطوط الخلايا البشرية وبكتيريا الإشريكية القولونية هي الخطر الحيوي.
وأخيرا، ينبغي أن يتم التعامل مع plasmids الحمض النووي المؤتلف من قبل الموظفين المدربين.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة بروتوكولًا يستخدم تقنية CRISPR لزيادة التعبير عن متغيرات تفريع متعددة من الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل. الطرق التقليدية القائمة على cDNA محدودة في قدرتها على التعامل مع تعقيد هذه الأشكال المتنوعة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الوراثة
- البيولوجيا الجزيئية
الخلفية
- يمكن أن يكون للحمض النووي الريبي غير المشفر أشكال متنوعة متعددة.
- يشكل دراسة جميع الأشكال المتنوعة المعبر عنها في المختبر تحديًا.
- تتيح تقنية CRISPR التعبير الدقيق عن الجينات.
- تستخدم هذه الطريقة آلية التضفير الجيني الذاتية.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة موثوقة لزيادة التعبير عن أشكال الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل.
- لتعزيز فهم وظيفة هذه الأشكال المتنوعة.
- لتوفير بروتوكول يمكن تكراره في إعدادات بحثية مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تقنية CRISPR لتحرير الجينات.
- تصميم RNAs توجيهية خاصة بالجينات المستهدفة.
- دراسات التعبير في المختبر للحمض النووي الريبي غير المشفر.
- عرض الإجراء بواسطة باحث ما بعد الدكتوراه.
النتائج الرئيسية
- يتيح البروتوكول بنجاح التعبير عن أشكال متنوعة متعددة.
- يتم استخدام آلية التضفير الذاتية بفعالية.
- تقنية مثبتة تعزز دراسة وظيفة الحمض النووي الريبي غير المشفر.
- يوفر إطارًا للأبحاث المستقبلية حول الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل.
الاستنتاجات
- تعتبر تقنية CRISPR أداة قوية لدراسة الحمض النووي الريبي غير المشفر.
- تحسن الطريقة من فهم وظيفة أشكال الحمض النووي الريبي.
- يمكن تكييف هذه الطريقة لمختلف دراسات الحمض النووي الريبي غير المشفر.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Overexpressing long noncoding RNAs (lncRNAs) using CRISPR activation enables functional interrogation of disease-associated transcripts without cDNA limitations, supporting target validation in discovery pipelines. This approach addresses challenges posed by low expression, tissue specificity, and isoform complexity, providing a mechanism to assess lncRNA involvement in inflammatory pathways. By leveraging endogenous splicing, the method enhances predictive confidence in preclinical models and supports mechanistic de-risking of lncRNA targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lncRNA function in disease-relevant contexts such as inflammatory bowel disease using IFNG-AS1 as a model.
- Operational Value: Supports overexpression of multiple endogenous splice forms, increasing confidence in target engagement and pathway modulation.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by linking lncRNA overexpression to downstream phenotypic readouts like cytokine production.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, inducible overexpression systems suitable for high-content screening of lncRNA-modulating compounds.
- Operational Value: Produces quantifiable outputs via RT-qPCR with housekeeping gene normalization, enabling dose-response and temporal expression profiling.
- Scientific Value: Ensures expression of native isoforms, improving assay relevance compared to ectopic cDNA approaches.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses human Jurkat T-cells, enhancing translational relevance for immune-mediated diseases.
- Operational Value: Enables clonal expansion and selection, supporting consistent preclinical model generation.
- Scientific Value: Links lncRNA overexpression to functional immune outputs, supporting biomarker-aligned mechanism of action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for noncoding RNA targets where traditional overexpression fails.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling controlled overexpression of lncRNAs to assess phenotypic consequences in immune cells.
- Screening: Produces reproducible, inducible expression systems amenable to compound library screening for modulators of lncRNA activity.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized gene expression data via RT-qPCR, facilitating comparison across conditions and clones.
- Translational Research: Uses human T-cell model, enabling direct relevance to inflammatory disease pathways and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for lncRNA overexpression applicable across multiple targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling physiologic overexpression of multiple lncRNA isoforms.
- Operational Value: Provides a standardized, lentiviral-based system for consistent, scalable overexpression across experiments.
- Strategic Value: Reduces false negatives in target assessment by overcoming limitations of low-abundance lncRNA detection.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions in lncRNA target programs by providing mechanistic insight prior to investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, lentiviral production, and CRISPR-based transcriptional activation.
- Necessitates biosafety level 2 (BSL-2) facilities for handling lentiviral vectors and human cell lines.
- Depends on accurate gRNA design within 100 bp of transcriptional start site for effective activation.
- Requires validation of overexpression via isoform-specific or pan-transcript RT-qPCR with appropriate controls.
- Involves multi-day workflow including virus production, transduction, selection, and clonal expansion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:40
Vector Design and Generation
1:52
Virus Generation
4:24
Particle Count using p24 Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit
7:07
dCas9 and gRNA Transduction, Selection, and Clone Creation
10:18
Results: Using CRISPR Technology to Overexpress Multiple Splice Variants of a lncRNA
12:08
Conclusion
